用于检测多融合基因变异的试剂盒、探针及其设计方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测多融合基因变异的试剂盒、探针及其设计方法。其中探针组，其包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
用于检测多融合基因变异的试剂盒、探针及其设计方法


[0001]本专利技术属于基因检测领域，更具体而言，本专利技术涉及用于检测多融合基因变异的试剂盒、探针及其设计方法。

技术介绍

[0002]融合基因它是指两个或多个基因的编码区重新排列组合，共同置于一套ORF阅读框中，既可以发生在DNA水平上也可以发生在RNA水平上。大多数情况下，融合基因可以导致序列异常、某些基因表达失调及蛋白质功能异常，从而导致或促进肿瘤的发生。迄今，人们已经锁定了大约2万多个融合基因，但是它们在癌症发展中的确切功能和作用则知之甚少。因此，融合基因检测是对于肿瘤预测、临床肿瘤治疗的靶向用药设计具有非常重要意义。
[0003]目前常规融合基因检测方法主要有细胞核型分析、反转录
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聚合酶链反应(RT
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PCR)、荧光原位杂交(FISH)3种。细胞核型分析是基于较大范围染色体异常而进行的初步分析，其灵敏度取决于可供检测的中期细胞数，成功率相对降低只能检测中期细胞。RT
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PCR主要提取肿瘤组织中的mRNA，在反转录酶的作用下，合成cDNA，再以此为模板进行聚合酶链式反应。与提取肿瘤组织的DNA进行常规PCR相比，此法简单、快速，组织中只需要少量的肿瘤即可被检测，能显著提高肿瘤检测的特异性，但由于检测受RNA质量的影响，在石蜡等研究组织中敏感度较低。FISH技术最早由Pinkel等人报道，系采用标记有荧光分子的一小段DNA序列(探针)，在合适的湿度和盐离子浓度下，与组织切片或细胞涂片上的组织DNA杂交，在荧光显微镜下显示与之相应的染色体某个区域或整条染色体。该技术可以探查有丝分裂期间细胞核内染色体数目和结构的异常，尤其适用于证实染色体易位、缺失和基因扩增。其灵敏度高于传统的细胞核型分析且对检测样本的制备无特殊要求，既可用新鲜组织也可用于4％甲醛溶液固定或石蜡包埋的组织标本。尽管该方法已经被认为是临床上检测融合基因的金标准，然而其局限性在于样本的判读受制片和染色质量的影响，且不同厂家的探针往往质量差异较大，不易形成成熟的检测规范。
[0004]高通量测序技术可以并行地对数百万条短序列进行测序，已被广泛应用至对肿瘤突变的检测，然而目前的NGS方法很少同时对DNA和RNA进行最大化检测融合基因。
[0005]传统的融合检测的方案中，湿实验探针设计到干实验检测内容具有一些局限性。湿实验：1)探针设计时，通常只是根据相关融合数据库和文章既有报道去设计；2)投入临床实践使用时，很少是DNA+RNA双水平去检测；3)现有融合相关的热点靶向或生物标志物基因包含不全面；4)DNA水平设计探针时没考虑到基因间区到RNA水平的常见可变剪切；RNA水平就CDS中短的外显子的探针设计不跨相邻等处理；5)试剂盒固定不灵活：不适用于临床灵活组合基因们使用。干实验处理时：1)内容上单一，只有结构变异，注释内容仅仅只有结构重排或者仅仅融合的标注，很少区分是功能融合，还是激酶结构域结构重复(KDD)，或者外显子跳跃(skip)或者复杂结构重排；2)仅仅是很少RNA水平结合DNA水平可检出融合的多样可变剪切形式，包含基因间区介导融合，内含子保留，外显子跳跃等；3)很少用自主从头开发软件，低频和新融合的高质量检出，并参数多而细，至少包含断点，亚型，预测功能类型，转
录本，和顺/反式，结构域包含，阅读框移码与否等；检出灵敏度和检出率有限，注释功能也有限。
[0006]附图简要说明
[0007]图1A
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D：显示了S1的3个样本分别检测出EGFR Exon 8
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25重复(KDD)，EGFR Exon2
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7缺失和EGFR:VSTM2A E24:E5；
[0008]图2：显示了S2对FGFR1:TACC1E18:E1低频已知经典融合的灵敏度提高；
[0009]图3：显示了S3对FGFR2:KIAA1217E17:E1低频已知罕见融合的灵敏度提高；
[0010]图4：显示了S4检测到的FGFR3的新融合FAM193A:FGFR3E11:E8；
[0011]图5：显示了S5对EML4:ALK E5:E20低频已知经典融合
[0012]图6：显示了S6样本在区域内捕获到新融合CD74:ROS1E6:E29；
[0013]图7：显示了S7发生在KIF5B:RET E15:E12这种经典融合上，提高了其检出率；
[0014]图8：显示了S8检测出的融合RPAP1:LTK E25:E2；
[0015]图9：显示了S9检测出的融合WRN:NRG1E19:E2；
[0016]图10：显示了S10检测出的低频新融合EWSR1:UPB1E5:E7；
[0017]图11：显示了S11对MGAM:BRAF E40:E9低频新融合
[0018]图12：显示了S12检测出的融合DEK:AFF2E7:E5；
[0019]图13：显示了S13检测出的融合TPM3:NTRK1E8:E10；
[0020]图14A
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B：显示了S14在RNA水平检出的CLDN18:ARHGAP26E5:E12，在DNA水平检测到断点所在的基因间区；
[0021]图15A
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C：显示了S15的3个样本分别检测出经典融合新亚型CAPZA2:MET E1:E2，罕见融合KIF5B:MET E24:E15和MET Exon 14跳跃；
[0022]图16：显示了S16检测出新融合ERBB2:STARD3E27:E2；
[0023]图17：显示了S17检测出的罕见融合新亚型EML4:NTRK2E6:E16,断点发生在NTRK2 Intron15；
[0024]图18：显示了S18检测出的罕见融合新亚型KIF23:NTRK3E10:E14,断点发生在NTRK3 Intron13；
[0025]图19A
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B：显示了S19检测出BRAF融合CNTNAP2:BRAF E2:E9的继发MET耐药扩增变异；
[0026]图20A
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B：显示了S20检测出FGFR2融合FGFR2:CTNNA3E17:E14的本基因上发生的FGFR2(NM_000141)的p.N549K(c.1647T>A)耐药突变。

技术实现思路

[0027]本专利技术人经过大量的实验研究，开发了一种用于检测多融合基因变异的探针及其设计方法，一次性囊括多个驱动融合基因，并且包含和兼容最新靶点，能够加快对应新药的研发，方便老药扩宽适应症。
[0028]DNA和RNA探针差别部分：DNA是参考基因组对应的常规CDS中的外显子以及其对外内含子延伸一定距离碱基对的长度，还有各基因设计的内含子区探针。RNA是有多条转录组覆盖CDS区域的整合，对于短的外显子(<120bp一条探针长度的)会相邻外显子的碱基连接设计。
[0029]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测多融合基因变异的探针组，其中所述探针组包含选自以下探针中的至少一种：用于检测EGFR基因的探针序列如SEQ ID NO:1
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50所示；用于检测FGFR1基因的探针序列如SEQ ID NO:51
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61所示；用于检测FGFR2基因的探针序列如SEQ ID NO:62
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89所示；用于检测FGFR3基因的探针序列如SEQ ID NO:90
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100所示；用于检测ALK基因的探针序列如SEQ ID NO:101
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111所示；用于检测ROS1基因的探针序列如SEQ ID NO:112
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122所示；用于检测RET基因的探针序列如SEQ ID NO:123
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133所示；用于检测LTK基因的探针序列如SEQ ID NO:134
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144所示；用于检测NRG1基因的探针序列如SEQ ID NO:145
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155所示；用于检测EWSR1基因的探针序列如SEQ ID NO:156
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166所示；用于检测BRAF基因的探针序列如SEQ ID NO:167
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177和SEQ ID NO:277
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280所示；用于检测DEK基因的探针序列如SEQ ID NO:178
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188所示；用于检测NTRK1基因的探针序列如SEQ ID NO:189
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199所示；用于检测CLDN18基因的探针序列如SEQ ID NO:200
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210所示；用于检测MET基因的探针序列如SEQ ID NO:211
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243所示；用于检测ERBB2基因的探针序列如SEQ ID NO:244
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254所示；用于检测NTRK2基因的探针序列如SEQ ID NO:255
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265所示；和用于检测NTRK3基因的探针序列如SEQ ID NO:266
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276所示；其中所述融合基因为以上任意一个基因得到的融合基因。2.根据权利要求1所述的探针组，其中所述探针组由SEQ ID NO:1
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280的序列所示的探针组成。3.用于检测多融合基因变异的检测试剂，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的探针组。4.根据权利要求3所述的检测试剂，其中所述检测试剂还包括：RNA核酸反转录处理所需试剂、gDNA文库和cDNA文库构建的构建过程所需试剂、获得gDNA捕获文库和cDNA捕获文库所需除了权利要求6所述探针以外的其他试剂、DNA阴性质控品、DNA阳性质控品、RNA阴性质控品以及RNA阳性质控品。5.权利要求1或2所述的探针组和权利要求3或4所述的检测试剂在制备用于检测多融合基因变异的试剂盒中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其中所述检测多融合基因变异包括以下步骤：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凯，陈惠，庞菲，
申请(专利权)人：上海至本医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：