一种稳转细胞株、构建方法及其应用技术

本发明专利技术属于细胞生物学和生物技术领域，涉及一种稳转细胞株、构建方法及其应用，该稳转细胞株，表达CSF1R报告基因，该稳转细胞株命名为CSF1R报告基因稳转细胞株SCF4，保藏日期为2023年1月10日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2022357。本发明专利技术提供的稳转细胞株表达CSF1R报告基因，且能够在无血清条件下进行功能学试验的具体方法，有效的降低了报告基因方法的背景信号，在进行CSF1R激动剂/拮抗剂检测时具有优良的信噪比和稳定性。和稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种稳转细胞株、构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞生物学和生物
，涉及一种稳转细胞株、构建方法及其应用，具体到CSF1R SRE报告基因表达HEK293T稳转细胞株，并对该细胞株进行了无血清驯化培养，利用该细胞株进行CSF1R激动剂功能活性实验，利用该细胞株测定CSF1R抗体类药物的活性分析方法，本专利技术还进一步涉及到CSF1R抗体的中和抗体的检测方法。

技术介绍

[0002]CSF1R是一种单程酪氨酸激酶跨膜受体，属于Ⅲ型蛋白酪氨酸激酶受体家族，它主要表达在单核细胞和巨噬细胞表面，通过其活化调节巨噬细胞稳态，破骨细胞、小胶质细胞的发育等。CSF1R的主要受体为CSF1(MCSF；CSF
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1)，但也可以被IL
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34(IL34)激活，CSF1R在与受体结合后会形成同源二聚体，导致其激酶活性被激活，激活包括MAPK/ERK在内的许多细胞内信号通路。当ERK磷酸化时，Elk1与血清应答因子(SRF)形成复合物，并与血清应答因子(SRE)结合，导致大量有丝分裂诱导基因的表达。CSF1R/c
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FMS在许多肿瘤中的巨噬细胞内过度表达，因此，已被用作有希望治疗癌症和炎症性疾病的药物靶标。目前已有多个针对CSF1R激酶活性区的抑制剂或靶向CSF/CSF1R的抗体药物用于治疗CSF1R异常表达的疾病，进展最快的是FivePrime研发的抗CSF
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1R抗体Cabiralizumab(FPA008)，目前正在进行临床II期，探讨Cabiralizumab、Nivolumab联合或不联合化疗治疗晚期胰腺癌的疗效。而Roche研发的一款CSF
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1R单克隆抗体Emactuzumab，临床前的试验表明其能够有效地抑制M2类型的巨噬细胞，促进T细胞活性的增加。同时在腱鞘巨细胞瘤(TCGT)的临床试验中，也表现出积极的应答率86％(24/28)。其中的两例患者达到了完全缓解，进一步证明了CSF
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1/CSF
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1R信号通路的可靶向性。此外，CSF
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1诱导的巨噬细胞群还与炎症和骨疾病等多种疾病的病理学相关。因此，CSF1R在肿瘤及免疫类疾病方面都是一个非常有潜力的治疗靶点。
[0003]CSF1R在肿瘤及免疫类疾病中多异常表达，并启动下游信号通路，促进下游基因表达及细胞增殖。因此针对CSF1R的药物开发的关键在于是否阻断了CSF1R的异常表达的导致的活性加强，并以此开发CSF1R激酶活性抑制剂和靶向CSF1R或CSF
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1的抗体来阻断CSF1R配体与受体的结合，进而抑制级联反应的发生。对CSF1R的检测不能简单判断CSF1R蛋白的表达含量，更重要的是检测CSF1R的功能活性，因此可以通过构建表达CSF1R受体的细胞系进而检测CSF1R的功能，当CSF1R受体结合其特异性配体后，会激活MAPK/ERK信号通路，ERK磷酸化，随后启动血清应答因子(SRE)的表达，因此可以通过构建SRE控制表达的Luciferase来构建报告基因系统，通过与CSF1R构建共表达细胞系。当CSF1R受体被激活，激活内部级联信号，随后导致Luciferase的表达，便可以实现对CSF1R活性的检测。可以实现对CSF1R激动剂和CSF1R抗体的检测，也可以用来表征CSF1R抑制剂活性。
[0004]在针对CSF1R激动剂或者拮抗剂的生物活性检测方法中，多采用报告基因细胞学方法，但由于细胞培养过程中需要使用FBS，受培养基成分和FBS中细胞因子的影响会非特异的启动报告基因的激活，导致实验信噪比差，窗口期较短，稳定性差，无法作为稳固的方法使用。

技术实现思路

[0005]为解决CSF1R激动剂或者拮抗剂细胞学方法受培养基和FBS影响较大，本底信号很高，信噪比差，窗口期较窄，无法作为稳固的方法使用等问题，本专利技术首先开发一种HEK293T细胞无血清驯化方法，基于无血清培养体系，采用细胞报告基因的方法，筛选确定CSF1R下游转录因子SRE，并构建SRE Luciferase报告基因系统，CSF1R受体激活二聚化，进而激活下游SRE启动Luciferase的表达，通过检测Luciferase的信号来表征CSF1R激动剂/拮抗剂的功能活性。本专利技术同时开发了CSF1R功能细胞株能够在无血清条件下进行功能学试验的具体方法，有效的降低了报告基因方法的背景信号，在进行CSF1R激动剂/拮抗剂检测时具有优良的信噪比和稳定性。
[0006]基于本专利技术的上述目的，第一方面，本专利技术提供一种稳转细胞株，表达CSF1R报告基因，该稳转细胞株命名为CSF1R报告基因稳转细胞株SCF4，保藏日期为2023年1月10日，保藏地点为湖北，武汉，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2022357。
[0007]作为优选，利用CSF1R下游转录因子SRE，构建SRE Luciferase报告基因系统，转入HEK293T细胞而得到。
[0008]作为优选，所述转录因子SRE的核酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
[0009]本专利技术的第二方面，提供上述稳转细胞株的构建方法，包括如下步骤：
[0010]S1.无血清驯化HEK293T细胞；
[0011]S2.使用SRE Luciferase报告基因慢病毒转染HEK293T细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选得到合适的SRE Luc稳转细胞株；
[0012]S3.再次转染CSF1R基因慢病毒，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选，经功能学筛选出CSF1R SRE
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Luc HEK293T稳转细胞株单克隆。
[0013]作为优选，步骤S1中，依次使用DMEM完全培养基、50％DMEM完全培养基、25％DMEM完全培养基、12.5％DMEM完全培养基和SFM完全培养基对HEK293T细胞进行驯化培养。
[0014]作为优选，步骤S2中使用SRE Luciferase慢病毒感染HEK293T细胞，SFM完全培养基培养，第三天弃上清，SFM完全培养基重悬后，加压0.25μg/mL Puromycin，第20天，对单克隆进行评价筛选后，扩大培养。
[0015]本专利技术的第三方面，提供上述稳转细胞株的应用。
[0016]第一，上述稳转细胞株于CSF1R激动剂或者拮抗剂生物学活性测定的应用。
[0017]第二，上述稳转细胞株在CSF1R抗体的生物学活性检测中的应用。
[0018]通过实施上述技术方案，本专利技术通过使用无血清培养基SFM(gibco)和血清替代物UltroserTM G Serum Substitute(PALL)优化的细胞驯化方法，实现对HEK293T细胞的无血清驯化，使HEK293T细胞能够在无FBS条件下，仅含有少量血清替代物的条件下生长。随后使用SRE Luciferase报告基因慢病毒转染HEK293T细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选得到合适的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳转细胞株，其特征在于，该稳转细胞株命名为CSF1R报告基因稳转细胞株SCF4，保藏日期为2023年1月10日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2022357。2.根据权利要求1所述的一种稳转细胞株，其特征在于，利用CSF1R下游转录因子SRE，构建SRE Luciferase报告基因系统，转入HEK293T细胞而得到。3.根据权利要求2所述的一种稳转细胞株，其特征在于，所述转录因子SRE的核酸序列如SEQ ID NO.:1所示。4.根据权利要求1
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3任一项所述稳转细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.无血清驯化HEK293T细胞；S2.使用SRE Luciferase报告基因慢病毒转染HEK293T细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选得到合适的SRE Luc稳转细胞株；S3.再次转染CSF1R基因慢病毒，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选，经功能学筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄启宽，朱国振，余跃云，任亚哲，薛艺菲，
申请(专利权)人：上海精翰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：