一种免疫逃逸外泌体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，提供一种免疫逃逸外泌体及其制备方法，通过基因工程技术构建嵌合体分子CD47

【技术实现步骤摘要】
一种免疫逃逸外泌体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种免疫逃逸外泌体及其制备方法。

技术介绍

[0002]药物递送系统(Drug delivery system，DDS)是指可分别在时间、空间还有剂量上对药物于生物体内分布进行全面调控的技术体系。在纳米技术发展过程中，发现并制造了各种各样的多功能纳米材料，广泛应用于医学领域。最常用的纳米载药系统是脂质体和聚合物纳米颗粒。脂质体纳米颗粒是一类具有磷脂膜的合成囊泡，在水环境中可自行组装成各种大小和形状；聚合物纳米颗粒是一种药物递送系统，有助于药物分子的包裹、包封或附着。这两种递送系统都被用于传递不同类型的药物分子，包括抗癌药物、抗真菌药物和止痛剂等。但是，脂质体材料的毒性以及聚合纳米颗粒的生物相容性是药物递送载体难以克服的缺点。
[0003]纳米颗粒具有应用优势的同时，也面临挑战，传统化学方法获得的纳米颗粒存在融合率高，免疫原性强，稳定性低以及细胞毒性等缺陷，为药物递送研究提出新的挑战。外泌体这一细胞分泌产物作为直接纳米药物或药物递载体在一定程度上解决了上述缺陷，既具有纳米颗粒的优势，又弥补了其相关缺陷，是一种良好的生物纳米药物或药物载体，同源外泌体作为药物递送载体虽然可大大降低物理化学材料暴露在机体的毒性，但是并不能阻止机体单核细胞吞噬系统的快速免疫清除，因此血液循环半衰期短，递送效率低，大量外泌体聚集于肝脏、脾脏组织，到达病灶的药物相对较少，治疗效果不明显是外泌体作为纳米药物或药物递送载体的关键问题。

技术实现思路
r/>[0004]本专利技术旨在至少解决相关技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提供一种免疫逃逸外泌体的制备方法，包括如下步骤：
[0005]S1：基于CD47基因和CD63基因的CDS序列，以HBE细胞的cDNA为模板，PCR克隆CD47基因和CD63基因的全长cDNA，获得CD47的全长cDNA和CD63的全长cDNA；
[0006]S2：基于CD47的全长cDNA和CD63的全长cDNA，确定CD47免疫逃逸功能域序列和CD63外泌体富集功能域序列；
[0007]S3：将所述CD47免疫逃逸功能域序列和CD63外泌体富集功能域序列进行第二次克隆，获得嵌合体分子CD47
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CD63；
[0008]S4：对所述嵌合体分子CD47
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CD63的慢病毒表达质粒载体进行病毒包装，获得过表达嵌合体分子CD47
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CD63的慢病毒；
[0009]S5：用所述过表达嵌合体分子CD47
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CD63的慢病毒分别感染人源肺支气管上皮细胞HBE和鼠源胚胎成纤维细胞NIH/3T3，获得CD47
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CD63蛋白稳定过表达细胞系；
[0010]S6：对所述CD47
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CD63蛋白稳定过表达细胞系进行无血清细胞培养，获得细胞培养上清液，将所述细胞培养上清液进行差速离心后，再进行超速离心处理，获得免疫逃逸外泌
体。
[0011]根据本专利技术提供的一种免疫逃逸外泌体的制备方法，步骤S2操作步骤如下：
[0012]S21：基于所述CD47的全长cDNA作为模板，将带有CD63接头序列的CD47免疫逃逸功能域序列特异引物进行PCR克隆扩增，获得CD47免疫逃逸功能域编码线性DNA；
[0013]S22：基于所述CD63的全长cDNA作为模板，将带有CD47接头序列的CD63外泌体富集功能域序列特异引物进行PCR克隆扩增，获得CD63外泌体富集功能域编码线性DNA。
[0014]根据本专利技术提供的一种免疫逃逸外泌体的制备方法，步骤S3操作步骤如下：
[0015]S31：将所述CD47免疫逃逸功能域编码线性DNA作为模板，用CD47的前引物进行PCR克隆扩增，获得第一线性DNA；
[0016]S32：将所述CD63外泌体富集功能域编码线性DNA作为模板，用CD63的后引物进行PCR克隆扩增，获得第二线性DNA；
[0017]S33：将所述第一线性DNA和所述第二线性DNA进行拼接，获得嵌合体分子CD47
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CD63的线性DNA。
[0018]根据本专利技术提供的一种免疫逃逸外泌体的制备方法，步骤S4操作步骤如下：
[0019]将所述嵌合体分子CD47
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CD63的线性DNA进行酶切连接，再将所述嵌合体分子CD47
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CD63的线性DNA插入慢病毒表达载体pLV
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EF1α
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MCS
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IRES Puro上，获得嵌合体分子CD47
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CD63的慢病毒表达质粒载体，将所述嵌合体分子CD47
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CD63的慢病毒表达质粒载体和包装质粒共转染于293T细胞，获得过表达嵌合体分子CD47
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CD63的慢病毒。
[0020]根据本专利技术提供的一种免疫逃逸外泌体的制备方法，步骤S5操作步骤如下：
[0021]将所述过表达嵌合体分子CD47
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CD63的慢病毒与无抗生素培养基按1：1混合，获得混合培养基，向所述混合培养基中添加Polybrane，用以培养HBE和NIH/3T3细胞，12小时后，将HBE和NIH/3T3细胞置于基础培养基中，继续进行培养细胞48小时，然后在基础培养基中加入puro的抗性培养基对HBE和NIH/3T3细胞进行筛选培养，获得CD47
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CD63蛋白稳定过表达细胞系。
[0022]根据本专利技术提供的一种免疫逃逸外泌体的制备方法，所述基础培养基为添加1％抗生素和10％胎牛血清的培养基。
[0023]根据本专利技术提供的一种免疫逃逸外泌体的制备方法，步骤S6操作步骤如下：
[0024]S61：将所述CD47
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CD63蛋白稳定过表达的HBE和NIH/3T3细胞系在基础培养基中进行培养，细胞培养至密度约为80％；
[0025]S62：用PBS清洗所述密度约为80％的HBE和NIH/3T3细胞，再向清洗后的细胞中添加无血清培养基，培养36小时；
[0026]S63：收集所述细胞培养36小时上清液，将所述细胞培养上清液进行差速离心后，再用纳米孔径膜进行超滤，最后通过超速离心分离纯化所述细胞培养上清液中的外泌体，获得免疫逃逸外泌体。
[0027]一种基于本专利技术提供的一种免疫逃逸外泌体的制备方法制备的免疫逃逸外泌体，包含嵌合体分子CD47
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CD63。
[0028]本专利技术实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果之一：
[0029]本专利技术提供的一种免疫逃逸外泌体及其制备方法，通过基因工程技术构建嵌合体分子CD47
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CD63过表达人源肺支气管上皮细胞HBE和鼠源胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞株，
分离纯化富集嵌合体分子CD4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免疫逃逸外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：基于CD47基因和CD63基因的CDS序列，以HBE细胞的cDNA为模板，PCR克隆CD47基因和CD63基因的全长cDNA，获得CD47的全长cDNA和CD63的全长cDNA；S2：基于CD47的全长cDNA和CD63的全长cDNA，确定CD47免疫逃逸功能域序列和CD63外泌体富集功能域序列；S3：将所述CD47免疫逃逸功能域序列和CD63外泌体富集功能域序列进行第二次克隆，获得嵌合体分子CD47
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CD63；S4：对所述嵌合体分子CD47
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CD63的慢病毒表达质粒载体进行病毒包装，获得过表达嵌合体分子CD47
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CD63的慢病毒；S5：用所述过表达嵌合体分子CD47
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CD63的慢病毒分别感染人源肺支气管上皮细胞HBE和鼠源成纤维细胞NIH/3T3，获得CD47
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CD63稳定过表达细胞系；S6：对所述CD47
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CD63蛋白稳定过表达细胞系进行无血清细胞培养，获得细胞培养上清液，将所述细胞培养上清液进行差速离心后，再进行超速离心处理，获得免疫逃逸外泌体。2.根据权利要求1所述的一种免疫逃逸外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S2的操作步骤如下：S21：基于所述CD47的全长cDNA作为模板，将带有CD63接头序列的CD47免疫逃逸功能域序列特异引物进行PCR克隆扩增，获得CD47免疫逃逸功能域编码线性DNA；S22：基于所述CD63的全长cDNA作为模板，将带有CD47接头序列的CD63外泌体富集功能域序列特异引物进行PCR克隆扩增，获得CD63外泌体富集功能域编码线性DNA。3.根据权利要求1所述的一种免疫逃逸外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S3的操作步骤如下：S31：将所述CD47免疫逃逸功能域编码线性DNA作为模板，用CD47的前引物进行PCR克隆扩增，获得第一线性DNA；S32：将所述CD63外泌体富集功能域编码线性DNA作为模板，用CD63的后引物进行PCR克隆扩增，获得第二线性DNA；S33：将所述第一线性DNA和所述第二线性DNA进行拼接，获得嵌合体分子CD47
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CD63的线性DNA。4.根据权利要求1所述的一种免疫逃逸外泌体的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳世静，汤爽爽，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：