一种培养CHO/HEK细胞表达外源基因的方法技术

本发明专利技术提供了一种培养CHO/HEK细胞表达外源基因的方法，即在培养CHO/HEK细胞时，在CHO/HEK细胞的表达增殖过程中，添加辣椒素，抑制CHO/HEK细胞的增殖，从而以提高产物表达能力，本发明专利技术解决了现有技术中产物合成浓度较小的问题，具有很好的应用前景。具有很好的应用前景。具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种培养CHO/HEK细胞表达外源基因的方法


[0001]本专利技术涉及生物制药领域，特别是一种辣椒素在抑制CHO/HEK细胞表达中的应用。

技术介绍

[0002]在以重组CHO/HEK细胞为起始物料的生物制药大规模生产中，重组CHO/HEK细胞株需经复苏、增值、表达、收获、纯化、分装等上下游工艺实现产物量产，其中在上游的增值表达过程中，需将携带外源基因的重组CHO/HEK细胞培养增值至一定浓度后通过改变培养环境或添加生长抑制剂/稳定剂来抑制细胞增值，从而维持了较为稳定的细胞产物合成。
[0003]但是现有的生长抑制剂/稳定剂抑制细胞增值时，通常会对细胞活度产生影响，甚至还会影响产物的合成效率。因此急需找到一种既能有效抑制细胞增殖，又能保持细胞活度，保证产物合成效率的生长抑制剂/稳定剂。

技术实现思路
：
[0004]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种培养CHO/HEK细胞表达外源基因的方法，即在培养CHO/HEK细胞时，在CHO/HEK细胞的表达增殖过程中，添加辣椒素，辣椒素，化学名称为反式
‑8‑
甲基
‑
N
‑
香草基
‑6‑
壬烯酰胺，化学式为C
18
H
27
NO3是辣椒的活性成分，抑制CHO/HEK细胞的增殖，从而以提高产物表达能力，本专利技术解决了现有技术中产物合成浓度较小的问题，具有很好的应用前景。
[0005]一方面，本专利技术提供了一种培养细胞表达外源基因的方法，即在细胞培养过程中添加辣椒素。
[0006]进一步地，细胞培养选择的细胞为CHO/HEK细胞，在重组CHO/HEK的增殖表达过程中添加辣椒素。
[0007]进一步地，当CHO/HEK的细胞浓度达到3.5～4.0*107/mL时，添加辣椒素。
[0008]进一步地，添加的辣椒素的量为100～300uM/L。
[0009]在一些方式中，重组CHO细胞株常规培养在1000mL Flask瓶中，置于37℃250rpm摇床中进行培养，培养基成分包括CD CHO培养基及碳源/氮源及氨基酸。在细胞达到一定浓度后，转接种至5～10L培养瓶/20L Wave反应器/≥50L反应器中进行大规模培养。
[0010]在一些方式中，利用流式细胞仪检测当CHO细胞培养至一定浓度时，加入一定量的辣椒素。辣椒素作为细菌抑制剂，同时也能够抑制细胞的增值，在体外培养实验中，一定剂量的辣椒素能够改变细胞离子通道同时抑制转录因子的合成，从而使细胞保持在一个相对稳定的数量水平以达到产物合成的目的。同时，辣椒素能够有效抑制其他细菌的生长，大大降低了生产上游培养受污染的风险。
[0011]进一步地，所述辣椒素的制备工艺。
[0012]首先以干辣椒为原料，粉碎至颗粒度10～20目。
[0013]进一步地，使用乙醇进行提纯，固液比为20ml/g。
[0014]进一步地，运用超声波辅助萃取，其中功率要求1500W，萃取时间10分钟。
Flask瓶中，置于37℃250rpm摇床中进行培养，培养基成分包括CD CHO培养基(Gibco CD CHO Medium,Cat No.10743029)及碳源/氮源及氨基酸(L
‑
glutamine,40mL/L,HT supplement,10mL/L)。在细胞达到一定浓度后，转接种至5～10L培养瓶(接种后培养体积为1～3L)/20LWave反应器(接种后培养体积5～8L)/≥50L反应器中进行大规模培养(一般接种后培养体积为反应器体积50％～80％)。
[0035]辣椒素提纯制备工艺：以干辣椒为原料，粉碎至颗粒度10～20目，使用乙醇进行提纯，固液比为20ml/g，运用超声波辅助萃取，其中功率要求1500W，萃取时间10分钟。萃取阴离子交换树脂层析提纯，采用D296大孔阴离子树脂作为媒介，上样速度为50ml/hr，采用丙酮溶剂以100ml/hr洗脱，采用乙醚作为结晶溶剂在
‑
4℃结晶。详见说明书附图2。
[0036]当CHO/HEK细胞培养至3.5～4.0*107/mL时，在培养基中添加100～300uM/L的辣椒素，来抑制CHO细胞的增殖。详见说明书附图1。
[0037]实施案例二：不同抑制剂对抑制重组CHO细胞增殖的影响
[0038]按照实施案例一、二所述的专利技术方法，利用细胞计数仪检测当CHO细胞达到4.0*107/mL时，分别添加不同浓度的不同抑制剂至培养基中，每隔1h取样利用细胞计数仪检测细胞密度。每种浓度重复三次，实验结果如表一。
[0039]表一：不同抑制剂对抑制重组CHO细胞增殖的影响
[0040][0041]注：表中浓度数据为抑制剂加至培养基后整个培养基中所含抑制剂的浓度
[0042]由表一实验数据可知，将辣椒素作为抑制剂时，对于细胞的抑制作用效果明显优于丁酸钠/柠檬酸钠等抑制剂，说明用辣椒素作为抑制剂时，能够更加有效的抑制CHO细胞的增殖，从而使细胞进入产物表达阶段。
[0043]实施案例三：不同抑制剂对重组CHO细胞表达产物的影响
[0044]按照实施案例一所述的专利技术方法，利用细胞计数仪检测当CHO细胞达到4.0*107/mL时，分别添加一定量的辣椒素至培养基中，使培养基中辣椒素的浓度为100/200/300uM/L，每隔12h利用Beckman Vi
‑
CELL XR细胞计数及活率分析仪监测细胞活率及通过ELISA试
剂盒(Invitrogen，Human PD
‑
1ELISA Kit，Cat No.BMS2214)测定重组pd
‑
1抗体蛋白表达量。
[0045]Beckman Vi
‑
CELL XR细胞计数及活率分析仪测定方法：将Vi
‑
CELL XR试剂盒同对应颜色的设备管路进行连接并置于试剂槽内，按设备显示操作完成试剂替换。按照程序提示清空样品槽。检查试剂对应LED灯是否点亮并开始上样。取至少0.5mL样品置于样品杯，确认细胞类型及其他设置(如样品ID，稀释倍数等)后按要求操作开始进行细胞分析。
[0046]双抗夹心ELISA法测定蛋白浓度：将原有抗原用包被稀释后加入每孔10uL，室温下放置4h后弃去孔中液体。然后用PBS洗涤液清洗三次每次3分钟。将稀释好的样品(稀释比1：200)加入酶标反应孔中，每孔100uL，置于室温下60mins。再重复用PBS洗涤液清洗三次每次3分钟。加入梯度浓度的酶标抗体100uL每孔并在室温下静置60mins。PBS清洗三次每次3分钟后加入TMB底物液各100uL，于室温下避光静置25mins。最后每孔加入50uL终止液(2M H2SO4)。将制备好的待测样品置于ELISA检测仪上，对比阴性标本测定450nm波长下吸收值。
[0047]实验共测量三次，取结果平均浓度进行比较，实验结果如表二。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养细胞表达外源基因的方法，其特征在于，在细胞培养过程中添加辣椒素。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为重组CHO/HEK细胞，在重组CHO/HEK的增殖表达过程中添加辣椒素。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当CHO/HEK的细胞浓度达到3.5～4.0*107/mL时，添加辣椒素。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，添加的辣椒素的量为100～300uM/L。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述外源基因为全人源IgGX亚型重组单克隆抗体蛋白基因。6.一种抑制细胞增值的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张楚欣，许婕妤，王莹莹，
申请(专利权)人：张楚欣，
类型：发明
国别省市：