一种不依赖递氢体的呕吐毒素降解酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种不依赖递氢体可以降解呕吐毒素特性的突变体，与野生型相比，该突变体包含F103A和T493E两个突变位点，其氨基酸序列和核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。突变体SDH

【技术实现步骤摘要】
一种不依赖递氢体的呕吐毒素降解酶突变体


[0001]本专利技术属于农业生物
和基因工程
，具体涉及一种用于呕吐毒素降解应用的突变体。

技术介绍

[0002]脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又称呕吐毒素，是全球食品和饲料中检出率最高的真菌毒素。DON随食物进入机体后会产生多种毒理效应，少量摄入可造成动物采食量降低、生长受阻、营养转化效率低等现象，大量摄入可导致呕吐、腹泻、肠胃出血等现象。因此，在污染DON的粮食和饲料中实现高效的脱毒对解决畜禽健康养殖和污染粮食浪费等问题有重大现实意义。当前主要的脱毒方式包括物理、化学和生物等脱毒方式，但物理和化学方式不具备特异性，在脱毒过程中会造成营养物质的流失和适口性降低，不是解决毒素污染的最佳方式。而酶制剂脱毒具有特异性强、绿色、高效的显著优势，已经逐渐成为研究热点。
[0003]脱氢酶对DON具有降解作用，但目前报道的脱氢酶在降解DON的过程中通常需要递氢体吩嗪硫酸甲酯(Phenazine methosulfate，PMS)的参与。PMS对机体具有轻微毒性作用，并且在光照下易分解，不适合作为饲料脱毒酶的辅剂。减少DON降解酶对PMS的依赖对饲料脱毒应用具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种呕吐毒素降解酶突变体。与野生型相比，该突变体对DON的降解能力得到显著提高，并且可以不依赖于PMS存在降解呕吐毒素，有利于实际脱毒应用。
[0005]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0006]本专利技术所述的不依赖于PMS的呕吐毒素降解酶突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述将第103位的氨基酸进行突变。
[0008]在一种实施方式中，将第493位的氨基酸进行突变。
[0009]在一种实施方式中，所述载体为pET22b载体。
[0010]在一种实施方式中，所述重组菌可以是以大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母为宿主构建得到的。
[0011]本专利技术还提供了野生型SDH和突变体SDH
F103A
和SDH
F103A/T493E
在代谢DON中的应用。
[0012]优选的，在存在PMS的条件下，突变体SDH
F103A/T493E
具有更高效的DON降解率。
[0013]优选的，在不存在PMS的条件下，突变体SDH
F103A/T493E
仍具有DON降解能力。
[0014]优选的，突变体的孵育温度为10℃～30℃，pH为4～10。
[0015]优选的，突变体具有较强的热稳定性。
[0016]本专利技术具有以下优点和效果：
[0017]本专利技术提供的呕吐毒素降解酶突变体SDH
F103A/T493E
包含F103A和T493E两个突变位点。在PMS存在下，野生型在2小时内只能降解20％的DON，而突变体酶SDH
F103A/T493E
在5min内的降解率可达到80％。在PMS不存在下，野生型不能对DON进行降解，而SDH
F103A/T493E
仍然对DON具有降解能力。此外，在无PMS的体系中温度为10℃～30℃，pH为4～10范围内，SDH
F103A/T493E
对DON的相对活性可以保持80％以上。基于其可以不依赖于PMS的存在对DON具有降解作用，并具有较广的适用条件，该酶在呕吐毒素生物脱毒领域有良好的应用前景。
附图说明
[0018]图1为突变体的表达和纯化的SDS
‑
PAGE图。其中：M为蛋白质分子量标准，收集管为所纯化的蛋白；
[0019]图2为PMS对野生型SDH、突变体SDH
F103A
和SDH
F103A/T493E
降解率的影响；
[0020]图3为温度对SDH
F103A/T493E
降解DON活性的影响；
[0021]图4为pH对SDH
F103A/T493E
降解DON活性的影响；
[0022]图5为预加热处理对SDH
F103A/T493E
降解DON活性的影响。
具体实施方式
[0023]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。
[0024]实施例1呕吐毒素降解酶突变体表达载体构建
[0025]委托上海生工生物有限公司合成原始山梨糖脱氢酶(SDH)的基因序列，以pET22b
‑
SDH为模板，通过对103位和493位氨基酸点突变获得突变体。最终获得的突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0026]定点突变构建所用引物如下：
[0027]F103A
‑
F：5
′‑
ACATTGCAACCCTGAACTCCGCAGGTGAACCGACCCGTGG
‑3′
[0028]F103A
‑
R：5
′‑
CCACGGGTCGGTTCACCTGCGGAGTTCAGGGTTGCAATGT
‑3′
。
[0029]T493E
‑
F：5
′‑
ACAGGAAACCGGCGAAGAACTGTGGCAGACCCGTCT
‑3′
[0030]T493E
‑
R：5
′‑
AGACGGGTCTGCCACAGTTCTTCGCCGGTTTCCTGTG
‑3′
[0031]使用以上引物进行全质粒PCR，反应条件为：94℃2min；98℃30s，54℃30s，68℃7min，30个循环；对其PCR产物进行DnPI酶消化，将其转化入DH5α感受态，通过抗生素筛选提取阳性克隆子的质粒并送去测序；将测序正确的表达质粒pET22b
‑
SDH
F103A/T493E
转化入E.coli BL21(DE3)中，即可成功构建突变体的表达工程菌。
[0032]实施例2突变体表达纯化
[0033]将工程菌接种于10mL含氨苄霉素50μg/mL的LB培养基中，于37℃，200rpm摇菌。菌液浑浊后按1∶100的比例接入500mL含氨苄霉素50μg/mL的新鲜LB培养基中，37℃，200rpm摇菌。待菌液OD600值达到0.5～0.6时，加入终浓度为0.5mM诱导剂IPTG，25℃，150rpm诱导24h后收菌。将诱导后的菌液置于冰上预冷半个小时，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。收集的菌体用预冷的ddH2O重悬，4℃，5000rpm离心10min，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种不依赖于递氢体PMS的呕吐毒素降解酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO.1具有至少90％同一性的氨基酸序列，且突变为第103位、第493位氨基酸的单点突变或组合突变。2.包含根据权利要求1所述的一种呕吐毒素降解酶突变体，其特征在于，所述突变体是第103位氨基酸由苯丙氨酸变为丙氨酸，突变体是第493位氨基酸由苏氨酸变为谷氨酸，突变体是第103...

【专利技术属性】
技术研发人员：文继开，李丹阳，梁国强，邓诣群，母培强，吴骏，林如琴，陈庆梅，陈超，
申请(专利权)人：岭南现代农业科学与技术广东省实验室，
类型：发明
国别省市：