热稳定性提升的FDH突变体及其参与的辅酶再生系统技术方案

本发明专利技术公开了一种热稳定性提升的FDH突变体及其参与的辅酶再生系统，本发明专利技术利用力文所开发的基于深度学习算法的蛋白质设计平台

【技术实现步骤摘要】
热稳定性提升的FDH突变体及其参与的辅酶再生系统


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，更具体的是涉及一种热稳定性提升的FDH突变体及其参与的辅酶再生系统。

技术介绍

[0002]甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，FDH，EC1.2.1.2)广泛存在于微生物和高等植物中，且分布在所有的甲基营养型微生物中，其中甲基营养型Pseudomonas sp.101是迄今为止稳定性最高的野生型甲酸脱氢酶。该酶在生物法转化氨基酸生产中常用于还原型辅酶NADH的循环再生，能够以甲酸盐和氧化型辅酶NAD
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为底物转移氢的同时生成反应所需的还原力，并且副产物CO2容易被排出，对转化体系的pH影响小，因此被认为是合成光学活性化合物中NADH再生的最佳酶之一，广泛用于食品、制药和化学工业。
[0003]但是，野生型甲酸脱氢酶普遍存在酶活性低、催化效率差、在微生物中表达的蛋白可溶性较差的问题，且甲酸脱氢酶蛋白结构的较高柔性决定了野生型甲酸脱氢酶在生产所需的温度条件下容易变性失活，导致产品转化率低，影响产品的工业生产。一般而言，反应温度每提高10℃，反应速率会变为原水平的两倍；酶的热稳定性越强，则越是能够在较长的时间内维持高反应速率，从而提高相应的时空产率或者减少反应过程中所需的酶量，最终降低生产成本。因此，如何提高甲酸脱氢酶的热稳定性是目前亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种热稳定性均优于野生型的甲酸脱氢酶突变体。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：热稳定性提升的FDH突变体，其野生型序列如SEQ ID NO.1所示。该野生型甲酸脱氢酶来源于基因文库Uniport：P33160。对上述野生型甲酸脱氢酶选自以下至少一个氨基酸位点进行取代突变：D29E、Q49E、Y63F、N67R、D81N、V89P、D92E、L119I、Y246V、H264N、I266V、L271I、K272S、H29R、L36T、T38S、S131A、V137I、A211K、S228A、A239Q、T240S、R241W、D243S、I280L、V294I、R302Q、D364N、A373Q，得到甲酸脱氢酶突变体。
[0006]作为优选，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列至少选自以下突变集进行取代突变：
[0007]D29E/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。
[0008]作为优选，在没有A211K、T240S、V294I突变，S228A、A239Q、R241W不同时存在时，甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个或多个突变集进行取代突变：
[0009]D29E/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、H29R、L36T、T38S、S131A、V137I、A211K、S228A、A239Q、T240S、R241W、D243S、I280L、V294I、R302Q、D364N/A373Q，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶
的氨基酸序列。
[0010]作为优选，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个突变集进行取代突变：
[0011]D29E/H29R/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/A211K/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、
[0012]D29E/H29R/L36T/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/A211K/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、
[0013]D29E/H29R/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/S131A/L119I/A211K/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。
[0014]本专利技术的目的之二在于提供一种能够表达上述甲酸脱氢酶突变体的DNA或RNA。
[0015]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0016]一种甲酸脱氢酶重组基因，能够表达上述甲酸脱氢酶突变体的DNA或RNA。
[0017]本专利技术的目的之三在于提供一种包括上述能够表达热稳定性更优的甲酸脱氢酶突变体的DNA的重组质粒。
[0018]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0019]一种甲酸脱氢酶重组质粒，包括上述甲酸脱氢酶重组基因。
[0020]本专利技术的目的之四在于提供一种能够表达热稳定性更优的甲酸脱氢酶突变体的重组细胞。
[0021]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种甲酸脱氢酶重组细胞，包括如上述甲酸脱氢酶重组质粒。
[0022]作为优选，底盘细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、芽孢杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌、梭菌、链霉菌、葡萄球菌、奈瑟菌、志贺氏菌中的一种。
[0023]本专利技术的目的之五在于提供一种热稳定性更优的甲酸脱氢酶突变体参与的NAD
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NADH反应，为主酶反应体系提供NADH或仅用于生产NADH产品。
[0024]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种辅酶再生系统，包括上述甲酸脱氢酶突变体，所述甲酸脱氢酶突变体参与NAD
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NADH反应。
[0025]作为优选，甲酸脱氢酶重组细胞，所述甲酸脱氢酶重组细胞参与NAD
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NADH反应。
[0026]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术对野生型甲酸脱氢酶的序列进行改进，并进行生物实验验证，AI计算结果和生物实验结果表明，甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下至少一个突变进行取代突变：D29E、Q49E、Y63F、N67R、D81N、V89P、D92E、L119I、Y246V、H264N、I266V、L271I、K272S、H29R、L36T、T38S、S131A、V137I、A211K、S228A、A239Q、T240S、R241W、D243S、I280L、V294I、R302Q、D364N、A373Q，得到的突变体的热稳定性优于野生型。特别是，在没有A211K、T240S、V294I突变，S228A、A239Q、R241W不同时存在时，甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个或多个突变集进行取代突变：
[0027]D29E/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、H29R、L3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.热稳定性提升的FDH突变体，其特征在于所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下至少一个氨基酸位点进行取代突变：D29E、Q49E、Y63F、N67R、D81N、V89P、D92E、L119I、Y246V、H264N、I266V、L271I、K272S、H29R、L36T、T38S、S131A、V137I、A211K、S228A、A239Q、T240S、R241W、D243S、I280L、V294I、R302Q、D364N、A373Q，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的热稳定性提升的FDH突变体，其特征在于：所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列至少选自以下突变集进行取代突变：D29E/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的热稳定性提升的FDH突变体，其特征在于：在没有A211K、T240S、V294I突变，S228A、A239Q、R241W不同时存在时，甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个或多个突变集进行取代突变：D29E/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、H29R、L36T、T38S、S131A、V137I、A211K、S228A、A239Q、T240S、R241W、D243S、I280L、V294I、R302Q、D364N/A373Q，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴倩倩，管佳威，邹梨，刘作洋，
申请(专利权)人：杭州力文所生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：