硫醚单加氧酶突变体及其在制备手性拉唑药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及一种硫醚单加氧酶突变体；编码所述硫醚单加氧酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体；以及所述重组硫醚单加氧酶突变体在制备手性拉唑药物中的应用。与其它制备光学纯拉唑类药物的生物催化剂相比，本发明专利技术提供的硫醚单加氧酶突变体具有蛋白表达量高、催化活性高、溶剂耐受强、热稳定性好、产品光学纯度高、产率高等优势，在工业应用中显示出广泛的应用前景。用中显示出广泛的应用前景。用中显示出广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
硫醚单加氧酶突变体及其在制备手性拉唑药物中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，尤其是涉及一种硫醚单加氧酶突变体，编码所述硫醚单加氧酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，突变体酶制剂的制备，以及突变体酶制剂在制备手性拉唑药物中的应用。

技术介绍

[0002](S)
‑
奥美拉唑是治疗胃酸性消化疾病的质子泵抑制剂(Proton pump inhibitors，PPIs)药物，其于2001年获批上市，是奥美拉唑的S型光学异构体，它是市面上出现的第一个手性质子泵抑制剂，由阿斯利康公司所研发，化学名为S
‑5‑
甲氧基
‑2‑
[[(4
‑
甲氧基
‑
3,5
‑
二甲基
‑2‑
吡啶基)甲基]亚磺酰基]‑
1H
‑
苯并咪唑。目前在医院和药店所销售的多为(S)
‑
奥美拉唑镁三水合物，它的各项性质及结构特征已经得到充分研究。临床实践证明，与奥美拉唑相比，(S)
‑
奥美拉唑更加安全有效，具有更好的临床疗效，可以更好地控制胃酸分泌、缓解胃部疾病的症状。此外，(S)
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奥美拉唑的药效持续时间更长，不需要频繁服用，因此更受患者和医生的欢迎。由于其广泛的应用和良好的临床效果，(S)
‑
奥美拉唑已成为世界上最畅销的药物之一，对消化系统疾病的治疗做出了巨大贡献，在药物市场上占有举足轻重的地位。
[0003]目前(S)
‑
奥美拉唑在工业上均以化学法合成，但是化学法合成中普遍存的手性催化剂昂贵、立体选择性差等问题还无法避免；化学法合成中使用的大量过氧酸、H2O2、有机催化剂和有机溶剂等物质会对工作人员的身心健康及人类生活环境造成严重的伤害；化学反应条件相对苛刻，对生产设备的要求也很高，生产投入成本也随之增加。为响应绿色生活、绿色制造的时代号召，具有催化选择性好、反应条件温和、反应体系绿色环保等优点的生物合成法逐渐成为化学合成法的有益补充。
[0004]目前(S)
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奥美拉唑的生物法合成途径中主要以前手性硫醚为底物，利用整细胞、游离酶等作为催化剂催化其不对称氧化，得到光学纯的(S)
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奥美拉唑。目前已报道的可以用于(S)
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奥美拉唑合成的生物催化剂主要有：1)霉菌Cunninghamella echinulata MK40，可以催化7.5mM奥美拉唑硫醚不对称氧化，但转化率仅为45％；2)赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.B71生长细胞，可以催化0.1g/L奥美拉唑硫醚生成(S)
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奥美拉唑，但转化率也仅为70％；3)来源于Limnobacter sp.的PAMO可以通过整细胞不对称氧化50mM奥美拉唑硫醚生成(S)
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奥美拉唑；4)在美国Codexis公司公开的专利WO2011071982中，作者通过定向进化改造来源于Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871的环己酮单加氧酶突变体可以催化100g/L奥美拉唑硫醚合成(S)
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奥美拉唑，但需分5批添加冻干酶粉；5)专利CN108118035A公布了一种突变体可以催化165g/L奥美拉唑硫醚合成(S)
‑
奥美拉唑，但是这些专利存在使用提取酶用量大、耐受性差、催化剂制备繁琐、分离提取困难等问题；6)在专利CN113583985A和相关文献中报道实现了酵母胞外分泌表达，并能催化10g/L奥美拉唑硫醚，其催化剂制备简单，但是仍然存在酶表达量低、氧化活性较低、稳定性不足、底物上载量低等问题，很难满足工业生产的要求。

技术实现思路

[0005]针对酵母分泌表达硫醚单加氧酶用于合成手性亚砜药物(S)
‑
奥美拉唑过程中存在的酶表达量低、氧化活性较低、稳定性不足、底物上载量低等问题，本专利技术提供了一种硫醚单加氧酶突变体及其在制备手性拉唑药物中的应用。
[0006]本专利技术通过蛋白质工程的手段对其进一步的分子改造，提供一种蛋白表达量提升且对奥美拉唑硫醚催化活性、稳定性以及底物上载量显著提升的硫醚单加氧酶突变体，编码所述硫醚单加氧酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，重组硫醚单加氧酶突变体催化剂，以及重组硫醚单加氧酶催化剂在制备手性拉唑药物中的应用。
[0007]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0008]技术方案之一，本专利技术提供催化活性、表达量、稳定性、底物上载量显著提升的硫醚单加氧酶突变体。以氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的野生型硫醚单加氧酶(WT)，通过随机突变方法，结合酶标仪高通量初筛和进一步HPLC摇瓶复筛，鉴别获得多个蛋白表达量、催化活性、稳定性、底物上载量均显著提升的硫醚单加氧酶突变体。
[0009]本专利技术提供的硫醚单加氧酶突变体，为将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中的第17位Gly、第56位Ser、第58位Ser、第70位Glu、第83位Ser、第123位Asn、第128位Asn中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质；或，
[0010]为将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中的第131位Lys、第133位Thr、第207位Arg、第252位Thr、第321位Thr、第336位Glu、第456位His、第472位Thr、第526位Lys、第531位Lys中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质；
[0011]所述衍生蛋白质表达量、对奥美拉唑硫醚的氧化活性、稳定性均比SEQ ID No.2所示氨基酸序列对应的硫醚单加氧酶提升；所述衍生蛋白质表达量显著提高且对奥美拉唑硫醚的氧化活性显著提升，在稳定性方面也有所提高。
[0012]优选地，硫醚单加氧酶突变体的氨基酸序列为如下中的一种：
[0013](1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第17位Gly替换为Gln；
[0014](2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第56位Ser替换为Ala；
[0015](3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第58位Ser替换为Ala；
[0016](4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第70位Glu替换为Tyr；
[0017](5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第83位Ser替换为Gln；
[0018](6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位Asn替换为Phe；
[0019](7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第128位Asn替换为Thr；
[0020](8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第17位Gly替换为Gln本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种硫醚单加氧酶突变体，其特征在于，为将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中的第17位Gly、第56位Ser、第58位Ser、第70位Glu、第83位Ser、第123位Asn、第128位Asn中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质；或，为将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中的第131位Lys、第133位Thr、第207位Arg、第252位Thr、第321位Thr、第336位Glu、第456位His、第472位Thr、第526位Lys、第531位Lys中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质；所述衍生蛋白质表达量、对奥美拉唑硫醚的氧化活性、稳定性均比SEQ ID No.2所示氨基酸序列对应的硫醚单加氧酶提升。2.根据权利要求1所述的一种硫醚单加氧酶突变体，其特征在于，所述硫醚单加氧酶突变体是氨基酸序列如下中任一种所示的衍生蛋白质：(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第17位Gly替换为Gln；(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第56位Ser替换为Ala；(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第58位Ser替换为Ala；(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第70位Glu替换为Tyr；(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第83位Ser替换为Gln；(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位Asn替换为Phe；(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第128位Asn替换为Thr；(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第17位Gly替换为Gln，第56位Ser替换为Ala；(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第58位Ser替换为Ala，第123位Asn替换为Leu；(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第70位Glu替换为Tyr，第83位Ser替换为Gln，(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第17位Gly替换为Gln，第56位Ser替换为Ala，第58位Ser替换为Ala；(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第70位Glu替换为Tyr，第123位Asn替换为Leu，第128位Asn替换为Thr；(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第17位Gly替换为Gln，第70位Glu替换为Tyr，第123位Asn替换为Phe，第321位Thr替换为Ser；(14)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第131位Lys替换为Thr；(15)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第133位Thr替换为Ile；(16)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第207位Arg替换为Leu；(17)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第252位Thr替换为Asn；(18)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第321位Thr替换为Ser；(19)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第336位Glu替换为Lys；(20)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第456位His替换为Gln；(21)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第472位Thr替换为Ser；(22)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第526位Lys替换为Arg；(23)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第5...

【专利技术属性】
技术研发人员：郁惠蕾，周敏，秦鹏，耿强，张志钧，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：