蛋白可溶性表达提高的FDH突变体及其编码基因制造技术

本发明专利技术公开了一种蛋白可溶性表达提高的FDH突变体及其编码基因，本发明专利技术通过L

【技术实现步骤摘要】
蛋白可溶性表达提高的FDH突变体及其编码基因


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，更具体的是涉及一种蛋白可溶性表达提高的FDH突变体及其编码基因。

技术介绍

[0002]甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，FDH，EC1.2.1.2)广泛存在于微生物和高等植物中，且分布在所有的甲基营养型微生物中，其中甲基营养型Pseudomonas sp.101是迄今为止稳定性最高的野生型甲酸脱氢酶。该酶在生物法转化氨基酸生产中常用于还原型辅酶NADH的循环再生，能够以甲酸盐和氧化型辅酶NAD
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为底物转移氢的同时生成反应所需的还原力，并且副产物CO2容易被排出，对转化体系的pH影响小，因此被认为是合成光学活性化合物中NADH再生的最佳酶之一，广泛用于食品、制药和化学工业。
[0003]但是，野生型甲酸脱氢酶普遍存在酶活性低、催化效率差、在微生物中表达的蛋白可溶性较差的问题，且甲酸脱氢酶蛋白结构的较高柔性决定了野生型甲酸脱氢酶在生产所需的温度条件下容易变性失活，导致产品转化率低，影响产品的工业生产。因此，如何提高甲酸脱氢酶的可溶性表达和热稳定性是目前亟待解决的技术问题。甲酸脱氢酶的分子改造是指通过基因工程或蛋白工程等方法，对甲酸脱氢酶的结构和功能进行定向调控，以提高其在特定条件下的催化效率和稳定性。分子改造的方法有很多，比如突变、插入、缺失、融合、表面展示等。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种可溶性表达和热稳定性均优于野生型的甲酸脱氢酶突变体。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：蛋白可溶性表达提高的FDH突变体，其野生型序列如SEQ ID NO.1所示。该野生型甲酸脱氢酶来源于基因文库Uniport：P33160。对上述野生型甲酸脱氢酶选自以下至少一个氨基酸位点进行取代突变：Y63F、L119I、S132A、R136H、S229E、A240E、R242I、Y246L、R302Q、F356W、D364E、A373K，得到甲酸脱氢酶突变体。
[0006]作为优选，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列至少选自以下突变集进行取代突变：
[0007]S132A/R136H/S229E/A240E/R241P/Y246L/R302Q/A373K，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。
[0008]作为优选，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个或多个突变集进行取代突变：S132A/R136H/S229E/A240E/R241P/Y246L/R302Q/A373K、Y63F、L119I、F356W、D364E，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。
[0009]作为优选，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个突变集进行取代突变：
[0010]S132A/R136H/S229E/A240E/R241P/Y246L/R302Q/A373K、
[0011]Y63F/L119I/S132A/R136H/S229E/A240E/R241P/Y246L/R302Q/D364E/A373K、Y63F/L119I/S132A/R136H/S229E/A240E/R242I/Y246L/R302Q/F356W/D364E/A373K，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。
[0012]本专利技术的目的之二在于提供一种能够表达上述甲酸脱氢酶突变体的DNA或RNA。
[0013]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0014]一种甲酸脱氢酶重组基因，能够表达上述甲酸脱氢酶突变体的DNA或RNA。
[0015]本专利技术的目的之三在于提供一种包括上述能够表达蛋白可溶性表达量和热稳定性均更优的甲酸脱氢酶突变体的DNA的重组质粒。
[0016]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0017]一种甲酸脱氢酶重组质粒，包括上述甲酸脱氢酶重组基因。
[0018]本专利技术的目的之四在于提供一种能够表达蛋白可溶性表达量和热稳定性均更优的甲酸脱氢酶突变体的重组细胞。
[0019]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种甲酸脱氢酶重组细胞，包括如上述甲酸脱氢酶重组质粒。
[0020]作为优选，底盘细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、芽孢杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌、梭菌、链霉菌、葡萄球菌、奈瑟菌、志贺氏菌中的一种。
[0021]本专利技术的目的之五在于提供一种蛋白可溶性表达量和热稳定性均更优的甲酸脱氢酶突变体参与的NAD
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NADH反应，为主酶反应体系提供NADH或仅用于生产NADH产品。
[0022]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种NADH参与的生物催化系统，包括上述甲酸脱氢酶突变体，所述甲酸脱氢酶突变体参与NAD
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NADH反应。
[0023]作为优选，甲酸脱氢酶重组细胞，所述甲酸脱氢酶重组细胞参与NAD
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NADH反应。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术突变后的甲酸脱氢酶突变体RP31～37的蛋白可溶性表达量和热稳定性均有较大提升。特别是RP31和RP33，可溶性表达量均达到了野生型的300％以上，在60℃孵育90min后的剩余酶活均达到了野生型的200％左右。因此，本专利技术本专利技术突变后的甲酸脱氢酶在相同发酵条件下可以得到更多可用于催化的酶量，同时突变体参与的NAD
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NADH反应体系可以在较高温度下反应，该反应体系的催化效率可以明显提高，适于工业推广。
附图说明
[0025]图1为NADH溶液浓度
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A
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的吸光度的标准曲线图；
[0026]图2为野生型甲酸脱氢酶酶活与温度的关系图。
具体实施方式
[0027]DNA构建体，是指能表达出本专利技术的甲酸脱氢酶及甲酸脱氢酶突变体的序列。通常，DNA构建体通过PCR或本领域已知的其他合适技术在体外合成。在某些实施方案中，DNA构建体还包括其他附件元件，如控制元件(如启动子等)。DNA构建体还可以包括标记物质(如荧光等)。DNA构建体还可以包括不影响目的基因表达的其他序列。
[0028]术语“表达”是指DNA转录成信使RNA(mRNA)，然后翻译成蛋白质的过程。
[0029]“表达载体”具有在宿主细胞中掺入和表达异源多核酸片段的能力。许多原核和真核表达载体是市售的。选择合适的表达载体在技术人员的知识范围内。
[0030]术语“宿主细胞”是指用于表达包含本专利技术DNA的合适宿主载体。宿主可以包含任何能够包含和表达本文所公开的核酸或基因的生物体，但不限于此。宿主可以是原核生物或真核生物，单细胞或多细胞，包括哺乳动物细胞、植本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蛋白可溶性表达提高的FDH突变体，其特征在于所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下至少一个氨基酸位点进行取代突变：Y63F、L119I、S132A、R136H、S229E、A240E、R242I、Y246L、R302Q、F356W、D364E、A373K，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的蛋白可溶性表达提高的FDH突变体，其特征在于：所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列至少选自以下突变集进行取代突变：S132A/R136H/S229E/A240E/R241P/Y246L/R302Q/A373K，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的蛋白可溶性表达提高的FDH突变体，其特征在于：所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个或多个突变集进行取代突变：S132A/R136H/S229E/A240E/R241P/Y246L/R302Q/A373K、Y63F、L119I、F356W、D364E，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的蛋白可溶性表达提高的FDH突变体，其特征在于：所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个突变集进行取代突变：S132A/R136H/S229E/A240E/R241P/Y246...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘薇，王浩博，陈波，
申请(专利权)人：杭州力文所生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：