一种烯烃还原酶突变体及高效合成（R）-香茅醛的方法技术

本发明专利技术公开了一种烯烃还原酶突变体及高效合成(R)

【技术实现步骤摘要】
一种烯烃还原酶突变体及高效合成(R)
‑
香茅醛的方法


[0001]本专利技术涉及一种烯烃还原酶突变体及高效合成(R)
‑
香茅醛的方法，属于生物


技术介绍

[0002](R)
‑
香茅醛的合成主要分为化学法，其化学合成的方法分为两个路线：其中一种是以肉豆蔻烯为起点(Takasago工艺)，另一种是以柠檬醛为起点(BASF工艺)。在Takasago工艺中，第一步是将肉豆蔻烯转化为中间化合物(N，N
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二乙基
‑
3，7
‑
二甲基(E)
‑
2，6
‑
辛二烯
‑1‑
胺)。然后N，N
‑
二乙基
‑
3，7
‑
二甲基(E)
‑
2，6
‑
辛二烯
‑1‑
胺在异构化、水解和过渡金属催化的作用下形成(R)
‑
香茅醛，其ee>98％。BASF工艺则更直接，通过高温蒸馏柠檬醛混合物，从而获得高纯度的香叶醇，将香叶醇氢化得到(R)
‑
香茅醛，其ee>87％。但在Takasago工艺和BASF工艺中由于基质缺乏手性必须使用昂贵的铑基催化剂，而铑基催化剂涉及到回收和使用寿命等问题。因此，用廉价的(E/Z)
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柠檬醛还原成(R)
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香茅醛的生物催化路线是具有广阔的应用前景。
>[0003](R)
‑
香茅醛的生物合成已经成为研究的热点，主要分为单酶一步合成法。单酶法的主要是通过混合底物(E/Z)
‑
柠檬醛通过OYE一步法合成(R)
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香茅醛。近年来，尽管人们努力挖掘新来源的OYE，然而只有OYE2p可以达到ee(R)>88.8％，部分研究尝试通过酶工程改变老黄酶的立体选择性，如OYE2y的突变体P76M/R330H和XenA的突变体C25G对(R)
‑
香茅醛的转化率为15.8
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33.5％，其ee>99％，然而，XenA的突变体C25G实现了非对映选择性生产(R)
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香茅醛，但转化率低下，不适用于大规模生物合成(R)
‑
香茅醛。

技术实现思路

[0004]本专利技术要提供一种通过半理性设计获得烯烃还原酶突变体高效生产(R)
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香茅醛的方法。
[0005]本专利技术提供一种来自于Corynebacterium glutamicum烯烃还原酶CgOYE的突变体，通过截短烯烃还原酶CgOYE序列N端的31个氨基酸(N31
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CgOYE)，将第81位异亮氨酸突变为亮氨酸，第128位色氨酸突变为丙氨酸，第190位组氨酸突变为丙氨酸(N31
‑
CgOYE
I81L/W128A/H190A
)。
[0006]本专利技术提供了一种烯烃还原酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，和/或，将第81位、第128位、第190位中的一个或多个氨基酸进行突变得到的。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短得到的；命名为：N31
‑
CgOYE。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为：N31
‑
CgOYE
H190A
。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述亲本酶烯烃还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，编码烯烃还原酶突变体酶N31
‑
CgOYE
H190A
的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，并将第128位色氨酸突变为丙氨酸，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为：N31
‑
CgOYE
W128A/H190A
。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，编码烯烃还原酶突变体酶N31
‑
CgOYE
W128A/H190A
的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，并将第81位异亮氨酸突变为亮氨酸，第128位色氨酸突变为丙氨酸，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为N31
‑
CgOYE
I81L/W128A/H190A
。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，编码烯烃还原酶突变体酶N31
‑
CgOYE
I81L/W128A/H190A
的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0015]本专利技术还提供了编码上述烯烃还原酶突变体的基因。
[0016]本专利技术还提供了携带上述基因的重组载体。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组载体是以pXMJ
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19、pET
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28a、pMA
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5或pET
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32a为表达载体。
[0018]本专利技术还提供了表达上述烯烃还原酶突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或钝齿棒杆菌为表达宿主。
[0021]本专利技术还提供了一种提高烯烃还原酶转化底物(Z)
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柠檬醛/(E)
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柠檬醛/(E/Z)
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柠檬醛非对映选择性合成(R)
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香茅醛活性的方法，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，和/或，将第81位、第128位、第190位中的一个或多个氨基酸进行突变，所述(E/Z)
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柠檬醛为(Z)
‑
柠檬醛和(E)
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柠檬醛的混合物。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述(E/Z)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烯烃还原酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短得到的；或所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸得到的；或所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，并将第128位色氨酸突变为丙氨酸，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸得到的；或所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，并将第81位异亮氨酸突变为亮氨酸，第128位色氨酸突变为丙氨酸，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸得到的。2.编码权利要求1所述烯烃还原酶突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的重组载体。4.表达权利要求1所述烯烃还原酶突变体，或携带权利要求2所述基因，或携带权利要求3所述重组载体的重组细胞。5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。6.一种提高烯烃还原酶转化底物柠檬醛非对映选择性合成(R)
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香茅醛活性的方法，其特征在于，所述底物为(Z)
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柠檬醛和/或(E)
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柠檬醛；所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐美娟，饶志明，张杰，熊涛，张显，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：