基于CBE介导的LGMD2G小鼠模型、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及基于CBE介导的LGMD2G小鼠模型、构建方法及应用，涉及动物基因工程技术领域，利用CBE单碱基基因编辑系统对小鼠Tcap基因c.244位点进行基因敲入，进而使所述小鼠的Tcap基因c.244位点由碱基C突变为碱基T，得到LGMD2G小鼠模型；所述CBE单碱基基因编辑系统包括sgRNA和BE4max mRNA；所述sgRNA的序列为SEQ ID NO.1。本发明专利技术成功的构建的LGMD2G小鼠(c.244T/T)模型，便于更加深入的探索LGMD2G的发病机理，筛选LGMD2G的治疗靶点，评估LGMD2G治疗策略的有效性和安全性、为开发普适性药物提供实验手段和技术。提供实验手段和技术。提供实验手段和技术。

【技术实现步骤摘要】
基于CBE介导的LGMD2G小鼠模型、构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及动物基因工程
，具体涉及基于CBE介导的LGMD2G小鼠模型、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]肢带型肌营养不良症2G(简称LGMD2G)是一类具有肢带肌无力、肌肉萎缩临床表现的常染色体隐性遗传的家族性疾病。患者的发病年龄在10岁以内，其临床主要表现为下肢近端盆带肌和下肢远端同等受累，上肢主要是近端受累；下肢远端主要为胫前肌萎缩无力，因而患者出现足下垂和足尖走路；腓肠肌多数肥大，但部分患者出现萎缩；肩胛肌萎缩出现翼状肩胛，通常没有颈肌和面肌受累或轻微受累；出现脊柱前突，踝、膝、肘关节的挛缩；血CK数倍到数十倍升高，但疾病晚期CK可以正常。多数患者在40岁后出现轮椅依赖。目前尚无有效治疗方法。
[0003]基因组编辑(简称为基因编辑)技术是利用人工核酸酶对基因组进行靶向修饰的遗传工程技术，是当今生命科学领域的研究热点。CRISPR/Cas9基因编辑系统虽然提高了基因敲除及定点修饰(包括定点突变及基因插入等)的效率，但是基于同源重组机制的基因定点突变效率仍然偏低。为了提高定点突变的效率，一项结合CRISPR/Cas9和胞嘧啶脱氨酶的单碱基编辑系统被相继报道，即单碱基编辑技术(简称CBE)。单碱基编辑技术可以精确地、不可逆地实现从一种碱基对到另一种碱基对的转变，而无需DSB或HDR。但是目前大多数关于单碱基编辑方法的研究报告主要基于细胞实验，而其在动物模型开发中的应用比较少，而将其应用在动物模型开发中有利于研究人员深入研究疾病发生和发展的机理。鉴于此，本专利技术提供一种基于CBE介导的LGMD2G小鼠模型的、构建方法及应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于CBE介导的LGMD2G小鼠模型、构建方法及应用。目的是构建的LGMD2G小鼠模型，便于更加深入的探索LGMD2G的发病机理，筛选LGMD2G的治疗靶点，评估LGMD2G治疗策略的有效性和安全性、为开发普适性药物提供实验手段和技术。
[0005]本专利技术为了解决上述技术问题，第一个目的是提供一种基于CBE介导的LGMD2G小鼠模型的构建方法，所述方法包括如下步骤：利用CBE单碱基基因编辑系统对小鼠Tcap基因c.244位点进行基因敲入，进而使所述小鼠的Tcap基因c.244位点由碱基C突变为碱基T，得到LGMD2G小鼠模型；
[0006]所述CBE单碱基基因编辑系统包括sgRNA和BE4max mRNA；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]上述方法中，所述Tcap基因c.244位点位于小鼠+1chr11染色体第98384297位点。
[0008]上述方法中，所述sgRNA在Crispr benching网站设计，满足以下要求：1)符合CBE单碱基基因编辑工具对编辑区PAM序列的要求；2)靶向小鼠Tcap基因编码序列，编辑窗口区
+4～+8位含C碱基；3)+4～+8位C碱基突变为T碱基后，可产生新的提前终止密码子；4)C>T的突变位点与已报道LGMD2G患者致病位点一致。
[0009]其中CBE单碱基基因编辑工具中靶向特异性是由两部分决定的，一部分是sgRNA嵌合和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白和一个短的靶DNA序列配对，这个短的靶DNA序列通常在靶DNA的3
’
末端作用，被称为PAM序列。
[0010]本专利技术的有益效果是：
[0011](1)本专利技术构建的LGMD2G小鼠模型，是基于CBE单碱基基因编辑技术制备的LGMD2G疾病小鼠模型。
[0012](2)本专利技术构建的LGMD2G小鼠模型突变位点与一例已报道LGMD2G病人的突变位点完全一致(Barresi et al.,2015)，能够更为真实的反应LGMD2G病人的病理状况。
[0013]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0014]进一步，所述方法包括使用所述sgRNA和所述BE4max mRNA的混合物的步骤。
[0015]上述所述sgRNA为按照MEGAshortscript T7 high yield Transcription Kit(AM1354)试剂盒操作步骤制备sgRNA，采用GENEART SGRNA KIT(A29377)试剂盒纯化回收sgRNA进行体外转录获得；所述BE4max mRNA先通过将pCMV_BE4max_P2A_GFP质粒线性化并回收BE4max片段，再采用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Transcription Kit(AM1345)试剂盒体外转录并纯化BE4 mRNA获得。
[0016]进一步，所述方法包括如下具体步骤：
[0017]1)将所述sgRNA和所述BE4max mRNA混合，得到注射液，即为CBE单碱基基因编辑系统；
[0018]2)采用显微注射的方法将所述注射液注射入小鼠受精卵的胞质中，得到注射后受精卵；
[0019]3)将所述注射后受精卵移植入代孕母鼠的输卵管内，发育完成后，得到F1代小鼠；
[0020]4)将所述F1代小鼠连续繁殖至少2代，并从后代中鉴定获得LGMD2G小鼠模型。
[0021]所述1)中，所述sgRNA和所述BE4max mRNA可定点识别和编辑小鼠基因组DNA中的Tcap基因c.244位点的DNA，使所述小鼠的Tcap基因c.244位点由碱基C突变为碱基T，最终构建得到小鼠基因组DNA的Tcap基因上出现C.244的点突变。
[0022]进一步，所述sgRNA和所述BE4max mRNA的质量比为1：2。
[0023]进一步，所述2)中，所述小鼠受精卵的供体为C57BL/6J小鼠。
[0024]上述步骤3)将所述注射后受精卵移植入代孕母鼠的输卵管内，发育完成后，得到F1代小鼠具体步骤：将注射后受精卵移植到代孕母鼠的输卵管内，完成手术缝合，妊娠期间，代孕母鼠单笼饲养，保证其饲养环境安静，多数情况下，代孕母鼠小鼠妊娠19
‑
21天，仔鼠F1代可自然产出。
[0025]进一步，所述代孕母鼠为ICR小鼠。
[0026]所述4)中，将所述F1代小鼠连续繁殖至少2代，并从后代中鉴定获得LGMD2G小鼠模型的方法具体如下：筛选Tcap杂合子F1代(c.244C/T)与F0代交配，通过测序检测子F2代小鼠Tcap基因的突变水平，选择Tcap杂合子小鼠(c.244C/T)进行交配，通过测序检测F2代小鼠Tcap基因突变水平，得到Tcap(c.244T/T)纯合子小鼠。
[0027]本专利技术的第二个目的是提供一种基于CBE介导的LGMD2G小鼠模型，所述LGMD2G小
鼠模型由如上述任一项所述的制备方法制备得到。
[0028]本专利技术的第三个目的是提供一种用于用于制备上述基于CBE介导的LGMD2G小鼠模型的试剂盒，所述试剂盒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CBE介导的LGMD2G小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：利用CBE单碱基基因编辑系统对小鼠Tcap基因c.244位点进行基因敲入，进而使所述小鼠的Tcap基因c.244位点由碱基C突变为碱基T，得到LGMD2G小鼠模型；所述CBE单碱基基因编辑系统包括sgRNA和BE4max mRNA；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述一种基于CBE介导的LGMD2G小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括使用所述sgRNA和所述BE4max mRNA的混合物的步骤。3.根据权利要求1或2所述基于CBE介导的LGMD2G小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤：1)将所述sgRNA和所述BE4max mRNA混合，得到注射液，即为CBE单碱基基因编辑系统；2)采用显微注射的方法将所述注射液注射入小鼠受精卵的胞质中，得到注射后受精卵；3)将所述注射后受精卵移植入代孕母鼠的输卵管内，发育完成后，得到F1代小鼠；4)将所述F1代小鼠连续繁殖至少2代，并从后代中鉴定获得LGMD2G小鼠模...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娜，宋亚锋，李善刚，陈丽娇，刘琳琳，杨戌妤，邓莉，李卓，肖红，夏侯志楷，张子莲，谢奇，
申请(专利权)人：北京体育大学，
类型：发明
国别省市：