一种产生诱导多能干细胞的方法、诱导多能干细胞和使用所述诱导多能干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及产生诱导多能干细胞的方法。本公开内容的方法包括在适合于重编程干细胞的条件下在脐带羊膜干细胞中表达编码蛋白OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和L

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种产生诱导多能干细胞的方法、诱导多能干细胞和使用所述诱导多能干细胞的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年7月20日提交的美国临时申请No.63/054,206的优先权权益，其内容通过引用整体结合于此以用于所有目的。

技术介绍

[0003]本专利技术涉及产生诱导多能干细胞的方法。另外，本专利技术涉及通过所述方法可获得的诱导多能干细胞群，以及通过所述方法获得的诱导多能干细胞群。本专利技术还涉及包含本专利技术的诱导多能干细胞的药物组合物。本专利技术还涉及使本专利技术的诱导多能干细胞分化的方法。另外，还涉及包含通过所述方法获得的分化诱导多能干细胞的药物组合物。此外，本专利技术涉及治疗受试者中的先天性或获得性退行性障碍的方法，其包括向受试者施用从多能干细胞分化的靶细胞。


[0004]干细胞是具有无限自我更新和在多种细胞或组织类型中分化的能力的细胞群。干细胞自我更新的能力对于它们作为原始未分化细胞的储库的功能是关键的，并且干细胞的“可塑性”依赖于它们转分化成不同于它们来源并且可能跨胚胎胚层的组织的能力。相反，由于端粒缩短，大多数体细胞自我更新的能力有限(综述于例如Dice,J.F.(1993)Physiol.Rev.73,149
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159)。因此，基于干细胞的疗法具有用于治疗多种人类和动物疾病的潜力。
[0005]胚胎干细胞(从受精后约3至5天)无限增殖，并可自发分化成所有组织类型：因此它们被称为多能干细胞(综述于例如Smith,A.G.(2001)Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.17,435
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462)。尽管胚胎干细胞的潜力是巨大的，但它们的使用意味着许多伦理问题。因此，非胚胎干细胞已被提议作为替代来源。
[0006]成体干细胞是更组织特异性的并且可能具有较少的复制能力：因此它们被称为多能干细胞(综述于例如Paul,G.等人(2002)Drug Discov.Today 7,295
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302)。这些细胞可以来源于骨髓基质、脂肪组织和真皮，并且具有分化成软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞、成肌细胞、心肌细胞、星形细胞和肌腱细胞的能力。然而，在许多情况下，从骨髓基质、脂肪组织、真皮和脐带血提取的干细胞的数量相当低。
[0007]非常年轻和适应性的成体干细胞(也称为新生干细胞)的广泛来源是脐带血或组织或胎盘。例如，大量干细胞可来源于脐带组织，即华通氏胶，脐带的基质(Mitchell,K.E.等人(2003)Stem Cells 21,50
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60；美国专利5,919,702；美国专利申请2004/0136967)。这些细胞已显示具有分别分化成例如神经元表型和软骨组织的能力。间充质干细胞也从脐带静脉的内皮下层分离，脐带静脉是脐带中发现的三条血管(两条动脉，一条静脉)之一(Romanov,Y.A.等人(2003)Stem Cells 21,105
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110；Covas,D.T.等人(2003)Braz.J.Med.Biol.Res.36,1179
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1183)。此外，间充质干细胞以及上皮干细胞已经成功地从
脐带羊膜组织分离(US2006/0078993)。尽管例如间充质干细胞可以在体外和体内经历分化，使得这些干细胞成为中胚层缺陷修复和疾病处理的有前景的候选者，但是成体干细胞的使用受到其多潜能性的限制。为了克服这种限制，非胚胎细胞可以重编程为多能干细胞：所谓的诱导多能干细胞(iPS)。
[0008]IPS是由Takahashi和Yamanaka首次产生的，他们通过过表达四种转录因子OCT3/4、SOX2、KLF4和C
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MYC(也称为Yamanaka因子)将非胚胎细胞重编程为多能状态(Takahashi,K.和Yamanaka,S.(2006),Cell,126(4),pp.663
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676)。详细地，Takahashi和Yamanaka使用了小鼠胚胎成纤维细胞，并经由逆转录病毒转导引入了Yamanaka因子，由此允许转录因子的过表达，并因此产生了表现出胚胎细胞的形态学和生长特性的细胞。尽管该方法是主要的突破，但是转导过程可能导致转移的DNA整合到宿主细胞的基因组中，使得iPS对于人类的治疗性治疗是批判性的。2011年Okita,K.等人，Nature methods,8(5),pp.409
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412已经建立了产生iPS的非整合替代方法。Okita等人使用电穿孔将编码Yamanaka因子的三个附加型质粒载体和用于p53抑制的p53
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shRNA转移到人皮肤成纤维细胞和牙髓中，因此允许外源DNA的过表达，由此产生无整合的人iPS。为了支持无整合的人iPS的生长和维持，Okita等人(同上)在由小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或STO细胞系组成的饲养层上培养iPS，所述细胞系已经用新霉素抗性和鼠LIF基因(SNL)转化。然而，饲养层上的培养可能带来外源DNA污染iPS的风险。因此，根据Okita等人(同上)的无插入的iPS对于人类的治疗性治疗也是批判性的。
[0009]在其概念后十年，iPS技术进入临床转化阶段，其中进行了人中首次试验用于年龄相关性黄斑变性(AMD；Mandai,M.等人，N Engl J Med,2017.376(11):p.1038
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1046)和帕金森病(PD；Reardon,S.和Cyranoski,D.(2014)
‘
Japan stem
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cell trial stirs envy
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,Nature.England,pp.287
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288.doi:10.1038/513287a)。iPS技术的最大希望在于其能够进行自体细胞治疗的潜力，这可以避免对长期免疫抑制或组织相容性匹配以防止移植细胞排斥的需要。这个范例已经在非人灵长类模型中用成纤维细胞和骨髓衍生的iPS得到证实(Morizane,A.等人，Stem Cell Reports,2013.1(4):p.283
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92；Hallett,P.J.等人，Cell Stem Cell,2015.16(3):p.269
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74；Wang,S.,等人，Cell Discov,2015.1:p.15012；Shiba,Y.等人，Nature,2016.538(7625):p.388
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391)，并且是用于AMD的基于iPS的细胞疗法首次人试验的基础(Mandai,M.等人，N Engl J Med,2017.376(11):p.1038
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1046)。然而，与临床级iPS生产相关的显著的时间和成本将使得其不可能大规模实施用于人类治疗。此外，存在从患者产生自体iPS可能不实际的情况。例如，对于携带致病突变的患者，在可以使用来自这些患者的iPS之前，必须首先校正这些突变。当突变是易处理的时，这是可实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生诱导多能干细胞的方法，其中所述方法包括在适合于重编程所述干细胞的条件下在脐带羊膜干细胞中表达编码蛋白OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和L
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MYC以及p53
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shRNA的外源核酸，由此产生所述诱导多能干细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脐带羊膜干细胞是脐带羊膜间充质干细胞或脐带羊膜上皮干细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述脐带羊膜间充质干细胞是间充质干细胞群，其中所述干细胞群的至少约90％或更多细胞表达以下标记物中的每一个：CD73、CD90和CD105。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述间充质干细胞群的至少约90％或更多细胞缺乏以下标志物的表达：CD34、CD45和HLA
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DR。5.根据权利要求3或4中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞群的至少约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多或者约99％或更多细胞表达CD73、CD90和CD105中的每一个并且缺乏CD34、CD45和HLA
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DR中的每一个的表达。6.根据权利要求1所述的方法，其中编码所述蛋白OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和L
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MYC以及p53
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shRNA的所述外源核酸由一种、两种或三种载体提供，其中优选地第一载体编码所述蛋白OCT3/4和所述53
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shRNA，第二载体编码所述蛋白SOX2和KLF4，并且第三载体编码所述蛋白L
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MYC和LIN28。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中使所述脐带羊膜干细胞经受转染以将所述外源核酸转移至所述干细胞中。8.根据权利要求7所述的方法，其中使所述脐带羊膜干细胞经受电穿孔以将所述外源核酸转移至所述干细胞中。9.根据权利要求8所述的方法，其中使所述脐带羊膜间充质干细胞经受1个脉冲的电穿孔，所述脉冲的持续时间为约15
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25ms，电压为约1550
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1650V，优选地经受1个脉冲的电穿孔，所述脉冲的持续时间为约20ms，电压为约1600V。10.根据权利要求9所述的方法，其中每种载体的载体(质粒)DNA的量与经受电穿孔的所述脐带羊膜间充质干细胞的数量的比率在约1.5μg质粒DNA比约1
×
106个CLMC至约2.5μg DNA比约1
×
106个CLMC的范围内，其中所述比率为，例如，约2.5μg质粒DNA:1
×
106个细胞，约2.25μg质粒DNA:1
×
106个细胞，约1.8μg质粒DNA:1
×
106个细胞，约1.7μg质粒DNA:1
×
106个细胞，约1.6μg质粒DNA:1
×
106个细胞，约1.5μg质粒DNA:1
×
106个细胞，或优选约1.67:1
×
106个细胞。11.根据权利要求8所述的方法，其中使所述脐带羊膜上皮干细胞经受2个脉冲的电穿孔，所述脉冲的持续时间为约25
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35ms，电压为约1300
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1400V，优选地，经受2个脉冲的电穿孔，所述脉冲的持续时间为约30ms，电压为约1350V。12.根据权利要求11所述的方法，其中每种载体的载体(质粒)DNA的量与经受电穿孔的所述脐细胞的羊膜上皮干细胞的数量的比率在约1.5μgDNA比约1
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106个细胞至约2.5μg DNA比约1
×
106个细胞的范围内，其中所述比率为，例如，约1.5μg质粒DNA:1
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106个细胞，约1.6μg质粒DNA:1
×
106个细胞，约1.7μg质粒DNA:1
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106个细胞，约1.8μg质粒DNA:1
×
106个细胞，约1.9μg质粒DNA:1
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106个细胞，约2.0μg质粒DNA:1
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106个细胞，约2.5μg质粒DNA:1
×
106个细胞，优选约1.67μg质粒DNA:1
×
106个细胞。13.根据权利要求7至12中任一项所述的方法，其中在适合于细胞回收的培养基中培养所述经转染的干细胞。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述适合于细胞回收的培养基是无血清培养基。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述适合于回收经转染的脐带羊膜间充质干细胞的培养基由约85％至95％(v/v)成分确定的培养基和5％至15％(v/v)胎牛血清组成。16.根据权利要求15所述的培养基，其中所述适合于回收经转染的脐带羊膜间充质干细胞的培养基由约90％(v/v)化学成分确定的培养基和约10％(v/v)胎牛血清组成。17.根据权利要求14或15中任一项所述的培养基，其中所述培养基含有约85％至95％(v/v)CMRL 1066和约5％至15％(v/v)FBS。18.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述适合于回收经转染的脐带羊膜上皮干细胞的培养基包含乳腺上皮基础培养基MCDB 170、EpiLife培养基、DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基)、F12(Ham
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s F12培养基)和FBS(胎牛血清)。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述适合于回收经转染的脐带羊膜上皮干细胞的培养基包含终浓度为约10％至约30％(v/v)的乳腺上皮基础培养基MCDB 170、终浓度为约20％至约40％(v/v)的EpiLife培养基、终浓度为约5％至约15％(v/v)的F12、终浓度为约30％至约45％(v/v)的DMEM和终浓度为约0.1％至2％(v/v)的FBS。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述适合于回收经转染的脐带羊膜上皮干细胞的培养基包含终浓度为约15％至约25％(v/v)的乳腺上皮基础培养基MCDB 170、终浓度为约25％至约35％(v/v)的EpiLife培养基、终浓度为约7.5％至约13％(v/v)的F12、终浓度为约35％至约40％(v/v)的DMEM和终浓度为约0.5％至1.5％(v/v)的FBS。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述适合于回收经转染的脐带羊膜上皮干细胞的培养基包含终浓度为约20％(v/v)的乳腺上皮基础培养基MCDB 170、终浓度为约30％(v/v)的EpiLife培养基、终浓度为约12.5(v/v)的F12、终浓度为约37.5％(v/v)的DMEM和终浓度为约1.0％(v/v)的FBS。22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中通过混合以下以获得1000ml终体积的培养基来获得所述适合于回收经转染的脐带羊膜上皮干细胞的培养基：200ml乳腺上皮基础培养基MCDB 170300ml EpiLife培养基250ml DMEM250ml DMEM/F121％胎牛血清。23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述适合于回收经转染的脐带羊膜上皮干细胞的培养基包含终浓度为约1μg/ml至约7.5μg/ml的胰岛素。24.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中所述适合于回收经转染的脐带羊膜上皮干细胞的培养基包含终浓度为约1ng/ml至约15ng/ml的人表皮生长因子。25.根据权利要求18至25中任一项所述的方法，其中所述适合于回收经转染的脐带羊膜上皮干细胞的培养基进一步包含以下补充物中的至少一种：腺嘌呤、氢化可的松和3,3
’
,5
‑
三碘
‑
L
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甲腺原氨酸钠盐(T3)。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述适合于回收经转染的脐带羊膜上皮干细胞的培养基包含腺嘌呤、氢化可的松和3,3
’
,5
‑
三碘
‑
L
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甲腺原氨酸钠盐(T3)中的全部三种。27.根据权利要求18至26中任一项所述的方法，其中所述适合于回收经转染的脐带羊膜上皮干细胞的培养基还包含一种或多种转化生长因子(TGF)。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述培养基包含转化生长因子β(TGF
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β)和/或转化生长因子α。29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中所述适合于回收经转染的脐带羊膜上皮干细胞的培养基进一步包含来自霍乱弧菌的霍乱毒素。30.根据权利要求14至29中任一项所述的方法，其中所述适合于细胞回收的培养基含有抑制炎性应答和增强细胞存活的化合物。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述化合物是糖皮质激素。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述糖皮质激素选自泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、倍他米松、皮质酮和氢化可的松。33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述氢化可的松的浓度为约0.5μM至约2μM。34.根据权利要求13至33中任一项所述的方法，其中所述培养在经涂布的细胞培养容器中进行，其中所述细胞培养容器优选地用血清来源的基质或无血清基质涂布。35.根据权利要求9至36中任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：新加坡卫生服务私人有限公司，
类型：发明
国别省市：