一种DNA修复蛋白用于修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤的方法技术

本发明专利技术公开了一种DNA修复蛋白用于修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤的方法，具体为一种提高DNA修复效率的蛋白、表达质粒、基因编辑质粒在修复基因编辑相关损伤的应用，所述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述基因编辑质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术的结果显示RAD52过表达载体能够显著增加宿主细胞内的RAD52基因在mRNA和蛋白质水平的表达量，本发明专利技术提供的蛋白和载体能够修复基因编辑所致损伤，相比于现有的通过抑制Cas9蛋白活性而降低基因编辑的方法，能够修复已经造成DNA损伤；本发明专利技术为修复基因编辑相关损伤的提供了一种新方法。相关损伤的提供了一种新方法。相关损伤的提供了一种新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA修复蛋白用于修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤的方法


[0001]本专利技术属于基因编辑与基因治疗
，具体涉及一种DNA修复蛋白用于修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤。

技术介绍

[0002]成簇规则间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)/CRISPR相关(CRISPR
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associated,Cas)系统原本是细菌中的一种适应性免疫系统，已经被开发成为了一种高效、方便的基因编辑工具，目前广泛应用于模型构建、基因治疗等领域。随着该技术的应用，其潜在的安全性风险也逐渐显现。已有研究表明，基因编辑技术在应用中存在脱靶、致癌、基因损伤等潜在的不良后果。因此，通过精准调控基因编辑技术以减少其应用中的潜在风险成为了近年来的研究热点。前期研究人员已经开发出了多种调控CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法，包括使用抗CRISPR蛋白、小分子化合物、光控元件融合表达的Cas9蛋白等。然而，这些方法通常是利用外源物质通过抑制或调控Cas9蛋白酶进而发挥抑制基因编辑效率的作用，利用宿主细胞自身内源基因进行调节的研究较少，考虑到宿主细胞基因组自身具有一套强大的基因损伤修复系统，因此建立一种通过增强宿主细胞内源基因修复能力降低CRISPR/Cas9基因编辑带来潜在基因损伤的方法，对于提高CRISPR/Cas9今后应用的安全性十分必要。
[0003]众所周知，CRISPR/Cas9基因编辑引发的DNA双链断裂(Double Strand Break，DSB)通常是通过宿主的DNA损伤修复系统进行修复，主要包括以下类型：非同源末端连接是通过连接酶直接将断裂末端进行连接，若断裂位点两端存在微同源序列也可通过微同源介导的末端连接途径进行修复，上述末端连接修复方式均是易错的，经常伴随着小插入或缺失(indels)。精准的同源重组修复途径利用位于姐妹染色单体上的同源序列或同源染色体作为模板进行修复，此外若断裂位点的两端存在长同源序列，还可以通过单链退火途径进行修复。近年来发现了一类新的同源重组修复机制
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转录相关的同源重组修复，其可以通过转录本RNA介导或直接以转录本RNA作为模板进行修复。在同源重组修复中，辐射敏感52(Radiation Sensitive 52，RAD52)蛋白发挥重要作用，其帮助辐射敏感51(Radiation Sensitive 51，RAD51)蛋白加载到单链DNA上进行后续同源模板寻找，同时也被首先募集到损伤部位招募下游的修复因子进而启动修复。

技术实现思路

[0004]基于现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种DNA修复蛋白用于修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤的方法，具体为一种提高DNA修复效率的蛋白、表达质粒、基因编辑质粒在修复基因编辑相关损伤的应用。
[0005]依据本专利技术的技术方案，一种DNA修复效率的蛋白或DNA修复蛋白的表达质粒或基因编辑质粒的应用，进一步为提高DNA修复效率的蛋白或DNA修复蛋白的表达质粒或基因编
辑质粒的应用，其为a)增强DNA修复；或b)提高DNA修复效率的产品；或c)制备增加或提高基因编辑安全性的产品。
[0006]优选的，所述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]优选的，所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0008]优选的，所述基因编辑质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0009]优选的，所述DNA修复为同源重组方式的DNA修复。
[0010]优选的，所述DNA修复为修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤。
[0011]优选的，所述提高DNA修复效率的产品包括提高DNA修复效率的质粒。
[0012]本专利技术还提供了一种修复基因编辑相关损伤的方法，所述方法包含过表达DNA修复蛋白RAD52的步骤。
[0013]与现有技术相比较，本专利技术所提供蛋白和质粒及其应用具有以下有益效果：
[0014](1)RAD52过表达载体能够显著增加宿主细胞内的RAD52基因在mRNA和蛋白质水平的表达量。
[0015](2)本专利技术提供的蛋白和载体能够修复基因编辑所致损伤，相比于现有的通过抑制Cas9蛋白活性而降低基因编辑的方法，能够修复已经造成DNA损伤。
附图说明
[0016]图1为pX459
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Alu的表达图谱。
[0017]图2为pCMV
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RAD52的表达图谱。
[0018]图3为RAD52过表达系统验证结果。
[0019]图4为RAD52过表达后HEK293细胞基因编辑损伤模型中细胞活性的检测结果。
[0020]图5为RAD52过表达后HEK293细胞基因编辑损伤模型中细胞汇合度检测结果。
具体实施方式
[0021]以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0022]本专利技术提供了一种DNA修复蛋白用于修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤的方法，具体为一种提高DNA修复效率的蛋白、表达质粒、基因编辑质粒在修复基因编辑相关损伤的应用。
[0023]依据本专利技术的技术方案，一种DNA修复效率的蛋白或DNA修复蛋白的表达质粒或基因编辑质粒的应用，进一步为提高DNA修复效率的蛋白或DNA修复蛋白的表达质粒或基因编辑质粒的应用，其为a)增强DNA修复；或b)提高DNA修复效率的产品；或c)制备增加或提高基因编辑安全性的产品。
[0024]优选的，所述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0025]优选的，所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0026]优选的，所述基因编辑质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0027]优选的，所述DNA修复为同源重组方式的DNA修复。
[0028]优选的，所述DNA修复为修复CRISPR/Cas9基因编辑相关宿主基因损伤。
[0029]优选的，所述提高DNA修复效率的产品包括提高DNA修复效率的质粒。
[0030]下面结合实施例说明本专利技术DNA修复效率的蛋白或DNA修复蛋白的表达质粒或基因编辑质粒的应用。
[0031]实施例1构建靶向Alu重复序列的基因编辑载体
[0032]CRISPR/Cas9系统的构建
[0033]引物合成
[0034]根据文献报道选择靶向Alu重复序列的sgRNA，序列如下表：
[0035]表1 Alu sgRNAs序列表
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高DNA修复效率的蛋白或DNA修复蛋白的表达质粒或基因编辑质粒的应用，其特征在于，所述应用为a)增强DNA修复；或b)提高DNA修复效率的产品；或c)制备增加或提高基因编辑安全性的产品。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述基因编辑质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙岩松，李浩，韩尧，杨兰，宋英杰，董雪，魏明臣，方梦雅，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：