一种携带双特异性启动子的载体、构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种携带双特异性启动子的载体、构建方法及其应用，本发明专利技术提供了一种双特异性启动子的载体，还提供了双特异性启动子的载体的构建方法，本发明专利技术还提供了包括前述双特异性启动子载体的宿主细胞、病毒及其制备方法，本发明专利技术还提供了相关的药物组合物，其能够在特定肿瘤细胞中特异性表达，实现肿瘤细胞的精准杀伤，同时本发明专利技术中双特异性启动子的载体在非肿瘤细胞中不表达或极少表达，降低了正常细胞受到误伤的概率，提高了安全性，具有广阔的市场应用前景。的市场应用前景。的市场应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种携带双特异性启动子的载体、构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种携带双特异性启动子的载体、构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]以腺相关病毒(adeno
‑
associated virus，AAV)为载体的基因药物具有基因表达持久、免疫原性低等特点，已经被广泛运用到单基因遗传病、眼科疾病、神经系统疾病等领域。但由于AAV对肿瘤细胞的侵染特异性不强，在侵染肿瘤细胞的同时也会侵染正常细胞，限制了其在肿瘤治疗领域的应用。
[0003]肿瘤特异启动子(Tumor
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specific promoter)为AAV在肿瘤领域的应用带来了希望。肿瘤特异启动子是指在肿瘤细胞中特异性表达的启动子序列。这些启动子具有与正常细胞相比更高的活性，或者仅在肿瘤细胞中被激活。肿瘤特异启动子的应用可以实现多种目的。首先，它们可以用于肿瘤基因治疗，通过将治疗基因与肿瘤特异启动子组合，使治疗基因仅在肿瘤细胞中表达，从而提高治疗的特异性和安全性。其次，肿瘤特异启动子也可以用于肿瘤免疫治疗，通过将免疫相关基因与肿瘤特异启动子组合，促进免疫细胞在肿瘤局部特异性的抗肿瘤反应。此外，肿瘤特异启动子还可以用于肿瘤诊断，通过将报告基因与肿瘤特异启动子组合，实现肿瘤细胞的可视化或分子探针的发展。

技术实现思路

[0004]肿瘤特异性启动子在正常细胞中有时也会异常启动，而每一次的启动表达都会对正常细胞或者组织产生一定的杀伤作用，为了弥补现有技术的不足，解决目前现有技术中存在的具体问题，本专利技术提供了一种携带双特异性启动子的载体、构建方法及其应用，在两个特异性启动子同时启动时具备杀伤功能，提高肿瘤治疗的精确性和安全性。
[0005]本专利技术提供了一种双特异性启动子的载体，所述双特异性启动子为两个特异性启动子。
[0006]所述载体包括：双特异性启动子分别连接目的基因。
[0007]所述目的基因包括以下组合中的至少一种：Casp1 act和GSDMD的组合、GSDMD C和GSDMD N的组合。
[0008]所述目的基因每一个组合中的两个组成成分可分别叫做目的基因1、目的基因2。
[0009]术语“载体”包括核酸序列的生物或化学部分，所述核酸序列可引入适当宿主细胞中以用于复制或表达所述核酸序列。载体包含非病毒载体和病毒载体。在本专利技术的一些实施方案中，非病毒载体可选自纳米颗粒、新颖生物材料、裸DNA、噬菌体、转座子、质粒、粘粒、人工染色体。质粒、其它克隆和表达载体、其特性以及可根据本专利技术使用的构建方法对本领域的技术人员显而易见。
[0010]进一步，所述双特异性启动子的两个启动子可分别叫做特异性启动子1、特异性启动子2。
[0011]进一步，所述双特异性启动子的载体的结构包括顺次连接的特异性启动子1、目的基因1、特异性启动子2、目的基因2。
[0012]进一步，所述特异性启动子与目的基因之间以特殊的粘性末端确保连接准确性。
[0013]进一步，所述特异性启动子是癌症相关特异性启动子。
[0014]进一步，所述癌症包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌，肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、以及头和颈部的癌。
[0015]进一步，所述双特异性启动子对应的两个启动子为PCA3、PEG3、人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，MUC
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1启动子、probasin基因启动子中的任意两种。
[0016]进一步，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸。
[0017]进一步，所述载体包括AAV病毒核心质粒。
[0018]进一步，所述双特异性启动子的载体包括结构为AAV
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PCA3
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Casp1act
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PEG3
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GSDMD的载体。
[0019]进一步，所述双特异性启动子的载体包括如SEQ ID NO:1所示的Casp1 act核苷酸序列。
[0020]进一步，所述双特异性启动子的载体包括如SEQ ID NO:2所示的GSDMD核苷酸序列。
[0021]进一步，所述双特异性启动子的载体包括如SEQ ID NO:3所示的PCA3核苷酸序列。
[0022]进一步，所述双特异性启动子的载体包括如SEQ ID NO:4所示的PEG3核苷酸序列。
[0023]进一步，所述双特异性启动子的载体的结构包括顺次连接的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
[0024]在某些实施方案中，所述双特异性启动子的载体的结构为AAV
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PCA3
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Casp1act
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PEG3
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GSDMD，是指在AAV病毒中顺次连接PCA3启动子、Casp1 act、PEG3启动子、GSDMD。在某些具体的实施方案中，所述AAV病毒中顺次连接PCA3启动子、Casp1 act、PEG3启动子、GSDMD包括顺次连接的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述双特异性启动子的载体的结构为AAV
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PEG3
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GSDMD
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PCA3
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Casp1 act，是指在AAV病毒中顺次连接PEG3启动子、GSDMD、PCA3启动子、Casp1 act。在某些具体的实施方案中，所述AAV病毒中顺次连接PEG3启动子、GSDMD、PCA3启动子、Casp1 act包括顺次连接SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
[0025]在某些实施方案中，所述载体除启动子以外，还可包含有其他适当的“调控元件”或“调控序列”，其包括但不限于增强子；转录因子；转录终止子；高效RNA处理信号，如剪接和聚腺苷酸化信号(polyA)；稳定胞质mRNA的序列，例如土拔鼠肝炎病毒(WHV)转录后调控元件(WPRE)；增强翻译效率的序列(即，kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和在需要时，增强所编码产物的分泌的序列。在某些实施方案中，所述polyA的实例包括SV40、牛生长激素(bGH)和TK polyA。在某些实施方案中，所述增强子的实例包括α胎蛋白增强子、TTR最小启动子/增强子、LSP(TH结合球蛋白启动子/α1
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微球蛋白/比库蛋白(bikunin)增强子)<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双特异性启动子的载体，其特征在于，所述双特异性启动子为两个特异性启动子；所述载体包括：双特异性启动子分别连接目的基因；所述目的基因包括以下组合中的至少一种：Casp1 act和GSDMD的组合、GSDMD C和GSDMD N的组合；所述目的基因每一个组合中的两个组成成分可分别叫做目的基因1、目的基因2；优选地，所述双特异性启动子的两个启动子可分别叫做特异性启动子1、特异性启动子2；优选地，所述双特异性启动子的载体的结构包括顺次连接的特异性启动子1、目的基因1、特异性启动子2、目的基因2；优选地，所述特异性启动子是癌症相关特异性启动子；优选地，所述癌症包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌，肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、以及头和颈部的癌；优选地，所述双特异性启动子对应的两个启动子为PCA3、PEG3、人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，MUC
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1启动子、probasin基因启动子中的任意两种；优选地，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸；优选地，所述双特异性启动子的载体包括结构为AAV
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PCA3
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Casp1act
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PEG3
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GSDMD的载体；优选地，所述双特异性启动子的载体包括如SEQ ID NO:1所示的Casp1 act核苷酸序列；优选地，所述双特异性启动子的载体包括如SEQ ID NO:2所示的GSDMD核苷酸序列；优选地，所述双特异性启动子的载体包括如SEQ ID NO:3所示的PCA3核苷酸序列；优选地，所述双特异性启动子的载体包括如SEQ ID NO:4所示的PEG3核苷酸序列；优选地，所述双特异性启动子的载体结构包括顺次连接的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2的核苷酸序列。2.一种双特异性启动子的载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法用于构建权利要求1所述的载体，所述构建方法包括：获取目的基因，所述目的基因包括以下组合中的至少一种：Casp1 act和GSDMD的组合、GSDMD C和GSDMD N的组合；获取双特异性启动子；将所述目的基因的组合和所述双特异性启动子组装在载体上，得到所述的载体；优选地，所述双特异性启动子的两个启动子包括PCA3、PEG3、人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，MUC
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1启动子、probasin基因启动子中的任意两种。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转
录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋灿，王振宇，冉杰，田甜，于杨，郭平，顾雨春，吴理达，
申请(专利权)人：呈诺再生医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：