本发明专利技术提供一种特异性表达hMRGPRX2的转基因小鼠的构建方法及其应用。本发明专利技术通过将人的MRGPRX2替换小鼠的同源基因Mrgprb2表达在小鼠肥大细胞中，成功构建出一种人源化小鼠，为研究MRGPRX2基因功能，筛选治疗肥大细胞上hMRGPRX2介导的药源性假性过敏以及神经感觉炎性反应相关疾病的药物提供了动物模型。炎性反应相关疾病的药物提供了动物模型。
【技术实现步骤摘要】
特异性表达hMRGPRX2的转基因小鼠的构建方法及其应用
[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种特异性表达hMRGPRX2的转基因小鼠的构建方法及其应用。
技术介绍
[0002]药物引起的过敏反应占所有药物副作用的15％，且其中很大一部分是非IgE介导的，被称为假性过敏反应，主要表现为给药部位的红肿、皮疹，、瘙痒以及全身性过敏反应，体温，血压和心率的变化等，严重影响生活质量。但目前仍然缺乏缓解或治疗药源性假性过敏反应的有效药物。最近研究表明，药源性假性过敏反应的发生与肥大细胞上高表达的受体MrgprX2有密切关系，它的激活可引发非IgE途径的肥大细胞脱颗粒。在野生小鼠上发现一些阳离子分子和神经肽类可以引发类过敏反应症状，但在Mrgprb2敲除转基因小鼠上却不能引发相同的过敏发应，用IgE介导的底物作用在Mrgprb2敲除的转基因小鼠上，依旧可以引发过敏反应，因此说明Mrgprb2介导了非IgE介导的肥大细胞脱颗粒反应。小鼠Mrgprb2与人MRGPRX2具有高度同源性，并且在体外转染Mrgprb2与MRGPRX2的HEK细胞上已经验证Mrgprb2与MRGPRX2均可以被一些阳离子药物和神经肽类激活。因此，hMRGPRX2是治疗假性药源性过敏反应的药物靶点，hMRGPRX2的拮抗剂将是治疗这类过敏反应的备选药物。
[0003]另外，神经炎性领域的很多疾病(特异性皮炎，荨麻疹等)也都与肥大细胞相关，并且近期研究证明感觉神经元分泌的一些物质(SP)可以直接激活肥大细胞上高表达的hMRGPRX2,进而介导肥大细胞释放前炎性因子和趋化因子，促进免疫细胞的迁移，因此，hMRGPRX2将是该疾病领域中具有潜力的靶点。
[0004]目前开发治疗假性药源性过敏以及神经免疫炎性疾病的技术瓶颈主要在于，缺乏精准的可以完整反应药理机制的动物模型，导致动物实验中应用有效的药物在转向临床用于人类时往往无效。这种药物疗效的差异会引起昂贵的临床前和临床研究失败。因此，特异性靶向人源蛋白/受体开发治疗疾病的药物将是今后药物开发的趋势，亟需建立合适的动物模型用于在体研究hMRGPRX2的功能，筛选和验证hMRGPRX2拮抗剂对药源性过敏反应以及感觉神经炎性反应的抑制作用，还可以筛选目前引起过敏反应副作用的上市药品。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供一种特异性表达hMRGPRX2(人源MRGPRX2)的转基因小鼠的构建方法及其应用。
[0006]本专利技术的技术原理：MRGPRX2可以介导肥大细胞脱颗粒相关的药源性过敏与神经炎性反应；小鼠的Mrgprb2与人MRGPRX2同源且均高表达在肥大细胞表面；通过人MRGPRX2替换小鼠Mrgprb2激活小鼠肥大细胞可以引起脱颗粒。本专利技术利用CRISPR
‑
Cas9基因敲入技术，构建特异性表达hMRGPRX2的转基因小鼠模型。此模型可以用于研究hMRGPRX2的功能，筛选并验证hMRGPRX2的拮抗剂，开发用于治疗药源性假性过敏和神经炎性反应相关疾病的药物。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种特异性表达hMRGPRX2的转基因小鼠的构建方法，所述方法包括：构建CRISPR
‑
Cas9系统介导的小鼠Mrgprb2基因敲除且定点整合外源基因
①
的转基因小鼠，命名为hMRGPRX2
‑
Cre。
[0008]所述外源基因
①
是由hMRGPRX2基因(编码区)和重组酶基因之间通过P2A序列(P2A自切割肽段序列)连接而成，且所述hMRGPRX2基因的3
’
端修饰有3
×
HA标签序列；其中，所述hMRGPRX2基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，hMRGPRX2基因的CDS序列如SEQ ID NO:2所示，mRNA对应的cDNA序列如SEQ ID NO:3所示。
[0009]进一步地，所述方法包括：根据小鼠Mrgprb2基因序列，构建基于CRISPR
‑
Cas9系统的sgRNA和Cas9表达载体，分别体外转录得到sgRNA和Cas9 mRNA，并根据sgRNA作用位点构建含有外源基因
①
且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的sgRNA和Cas9 mRNA以及供体质粒共同转入野生型小鼠的受精卵中，然后将克隆胚胎通过非手术法移入小鼠子宫内进行妊娠，获得转基因小鼠。
[0010]本专利技术的CRISPR
‑
Cas9系统靶向Mrgprb2阳性的小鼠细胞。
[0011]进一步地，所述sgRNA靶向小鼠Mrgprb2基因外显子2。
[0012]优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5
′‑
AGGTGCTTAGATTCTTGATTAGG
‑3′
和5
′‑
TTAGGCACCGAAGGTTCAGGCGG
‑3′
(SEQ ID NO:7
‑
8)。
[0013]前述的方法，所述重组酶为Cre重组酶。
[0014]进一步地，所述外源基因
①
为hMRGPRX2
‑3×
HA
‑
P2A
‑
iCre
‑
WPRE
‑
pA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0015]进一步地，所述供体质粒含有顺次连接的小鼠Mrgprb2基因5
’
同源臂片段、外源基因
①
和小鼠Mrgprb2基因3
’
同源臂片段。
[0016]优选地，所述小鼠Mrgprb2基因5
’
、3
’
同源臂片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和6所示。
[0017]优选地，所述小鼠为C57BL/6J。
[0018]第二方面，本专利技术提供按照所述方法构建的转基因小鼠的以下任一应用：
[0019](1)用作构建治疗或缓解人药源性假性过敏以及神经感觉炎性反应相关疾病的动物模型；
[0020](2)用于筛选治疗或缓解人药源性假性过敏以及神经感觉炎性反应相关疾病的药物；
[0021](3)用于检测引起人药源性假性过敏瘙痒症的物质；
[0022](4)用于筛选hMRGPRX2受体的激动剂或抑制剂；
[0023](5)用于hMRGPRX2基因功能的研究。
[0024]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0025]本专利技术通过将人的MRGPRX2替换小鼠的同源基因Mrgprb2表达在小鼠肥大细胞中，成功构建出一种人源化小鼠，即将hMRGPRX2特异性表达在小鼠Mrgprb2阳性的细胞中。提取小鼠皮肤组织中RNA进行RT
‑
PCR和体外细胞钙流测试证明了hMRGPRX2本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.特异性表达hMRGPRX2的转基因小鼠的构建方法，其特征在于，所述方法包括：构建CRISPR
‑
Cas9系统介导的小鼠Mrgprb2基因敲除且定点整合外源基因
①
的转基因小鼠；所述外源基因
①
是由hMRGPRX2基因和重组酶基因之间通过P2A序列连接而成，且所述hMRGPRX2基因的3
’
端修饰有3
×
HA标签序列；其中，所述hMRGPRX2基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据小鼠Mrgprb2基因序列，构建基于CRISPR
‑
Cas9系统的sgRNA和Cas9表达载体，分别体外转录得到sgRNA和Cas9mRNA，并根据sgRNA作用位点构建含有外源基因
①
且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的sgRNA和Cas9 mRNA以及供体质粒共同转入野生型小鼠的受精卵中，然后将克隆胚胎通过非手术法移入小鼠子宫内进行妊娠，获得转基因小鼠；所述CRISPR
‑
Cas9系统靶向Mrgprb2阳性的小鼠细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgRNA靶向小鼠Mrgprb2基因外显子2。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5
′‑
【专利技术属性】
技术研发人员：刘英骏，汪晓明，沈瑞超，李毓龙，雷晓光，闫培丽，马强，刘卓，
申请(专利权)人：海湃泰克北京生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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