用于原位分析的核酸类似物探针制造技术

在一些方面，本公开涉及用于探测生物样品中的分析物的蛋白质和核酸。在一些实施方案中，本文公开了一种方法，其中检测探针(例如，荧光标记的检测探针)可在合成主链上包含核碱基序列，所述检测探针因此比在糖

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于原位分析的核酸类似物探针
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2021年1月26日提交的标题为“NUCLEIC ACID ANALOG PROBES FOR IN SITU ANALYSIS”的美国临时申请号63/141,908的优先权，所述临时申请的内容出于所有目的通过引用以其全文并入本文。


[0003]在一些方面，本公开涉及用于原位分析生物样品中作为分析物或其他分析物的报告物的核酸分子的方法。

技术介绍

[0004]存在用于分析生物样品如细胞或组织中存在的核酸的方法。用于分析生物样品中存在的核酸例如用于原位分析的当前方法可能灵敏度和特异性低、复用性有限、结果偏倚、耗时、劳动密集和/或易于出错。需要用于分析生物样品中存在的核酸的改进方法。本文提供了满足此类及其他需要的方法、多核苷酸、多核苷酸组、组合物和试剂盒。

技术实现思路

[0005]在一些方面，本文提供了一种分析生物样品的方法，其包括：将多个检测探针与生物样品中的DNA多联体直接或间接地结合，其中所述多个检测探针中的一个检测探针在合成主链上包含核碱基序列，并且所述检测探针与DNA多联体中的靶标序列直接或间接地结合，和检测来自所述多个结合的检测探针的信号，其中生成的信号大于在糖
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磷酸主链上具有相同核碱基序列的多个参考检测探针。在一些实施方案中，所述多个检测探针中的至少一些在合成主链上包含核碱基序列。在一些实施方案中，所述多个检测探针中的每一个在合成主链上包含核碱基序列。在一些实施方案中，所述多个检测探针中的全部在合成主链上包含核碱基序列。在一些实施方案中，所述多个检测探针中的至少一些、每一个或全部为基于吗啉代物的探针。
[0006]在一些实施方案中，检测探针的静电负性可低于参考检测探针。
[0007]在前述实施方案中的任一个中，可以将检测探针直接或间接地偶联至可检测标记。在一些情况下，可检测标记包括荧光标记。在一些实施方案中，检测探针共价偶联(例如，经由键或经由接头部分)至可检测标记，例如荧光标记。在一些实施方案中，检测探针非共价偶联至可检测标记，例如荧光标记，例如经由结合对之间的非共价相互作用(例如，生物素偶联至检测探针而链霉亲和素偶联至可检测标记，或反过来)。在一些实施方案中，检测探针不直接偶联(例如，共价或非共价地)至可检测标记，并且检测探针可以是与可检测地标记的探针直接或间接地结合的中间探针，所述可检测地标记的探针直接或间接地偶联(例如，共价或非共价地)至可检测标记。在一些实施方案中，中间探针与共价偶联至可检测标记的可检测地标记的探针杂交。在前述实施方案中的任一个中，中间探针和/或可检测地标记的探针可以是核酸类似物探针，其在合成主链上包含核碱基序列，在所述合成主链中，
天然存在的核酸的主链中的糖被替换为吗啉(例如，亚甲基吗啉代物)环，并且亚甲基吗啉环由磷酰二胺部分连接。在一些实施方案中，本文公开的核酸类似物探针沿着分子具有中性电荷，并通过Watson
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Crick碱基配对与靶标核酸(例如，DNA或RNA，如DNA多联体)的互补序列结合。在一些实施方案中，本文公开的核酸类似物探针在碱基之间具有约3.4埃的间距。在一些实施方案中，核酸类似物探针在合成主链上包含与在糖
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磷酸主链上包含核碱基的参考探针相同的核碱基序列。
[0008]在前述实施方案中的任一个中，检测探针可与靶标序列直接杂交。在前述实施方案中的任一个中，检测探针可与和靶标序列直接或间接地结合的中间探针杂交。在前述实施方案中的任一个中，检测探针可与和靶标序列直接杂交的中间探针直接杂交。
[0009]在前述实施方案中的任一个中，检测探针可包括单链区域和任选地双链区域。
[0010]在前述实施方案中的任一个中，合成主链上的核碱基序列可以是第一探针序列，并且检测探针还可包括在糖
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磷酸主链上包含核碱基的第二探针序列。在前述实施方案中的任一个中，第一探针序列可以位于第二探针序列的5
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或3
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处。在前述实施方案中的任一个中，检测探针可包括一个或更多个第一探针序列和/或一个或更多个第二探针序列。在前述实施方案中的任一个中，第二探针序列可以是DNA序列、RNA序列或其组合。
[0011]在前述实施方案中的任一个中，检测探针可以任何合适的次序和组合包含核碱基A、T、C、G或U或它们的变体。
[0012]在前述实施方案中的任一个中，检测探针的长度可在约5至约50个核碱基之间。在一些情况下，检测探针的长度可在约10至约20个核碱基之间，在约20至约30个核碱基之间，或在约30至约40个核碱基之间。
[0013]在前述实施方案中的任一个中，检测探针可在合成主链中包含磷酰二胺键。在前述实施方案中的任一个中，检测探针可在合成主链中包含吗啉环。在前述实施方案中的任一个中，检测探针可以是吗啉代物。
[0014]在前述实施方案中的任一个中，检测探针可以是不带电荷的或带正电荷的。
[0015]在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以包含一个或更多个条形码序列，任选地其中所述靶标序列可以包含对应于生物样品中的分析物的条形码序列。
[0016]在一些实施方案中，DNA多联体为原位生成的产物。在一些实施方案中，DNA多联体为在细胞、细胞样品或组织样品如组织切片中原位生成的产物。在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以是生物样品中的内源性核酸分子的产物(例如，延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、逆转录产物和/或扩增产物如滚环扩增(RCA)产物)，任选地其中所述内源性核酸分子可以是病毒或细胞DNA或RNA，如基因组DNA/RNA、mRNA或cDNA。在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以是延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、逆转录产物和/或扩增产物。在一些实施方案中，DNA多联体为由滚环扩增(RCA)生成的产物。在一些实施方案中，DNA多联体为由在细胞、细胞样品或组织样品如组织切片中原位滚环扩增(RCA)生成的产物。在一些实施方案中，所述产物使用生物样品中的内源性核酸分子生成或与生物样品中的内源性核酸分子相关联。在一些情况下，内源性核酸分子为病毒或细胞DNA或RNA，如基因组DNA/RNA、mRNA或cDNA。
[0017]在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以是标记剂的产物(例如，延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、逆转录产物和/或扩增产物如滚环扩增(RCA)产
物)，标记剂可以与生物样品中的分析物直接或间接地结合。在前述实施方案中的任一个中，标记剂可以包含报告寡核苷酸，任选地其中所述报告寡核苷酸可以包含一个或更多个条形码序列并且DNA多联体包含所述一个或更多个条形码序列的一个或多个拷贝。在一些情况下，所述产物使用DNA聚合酶和/或RNA聚合酶生成。
[0018]在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以是与生物样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分析生物样品的方法，所述方法包括：将多个检测探针与所述生物样品中的DNA多联体直接或间接地结合，其中所述多个检测探针中的一个检测探针在合成主链上包含核碱基序列，并且所述检测探针与所述DNA多联体中的靶标序列直接或间接地结合，和检测来自所述多个结合的检测探针的信号，其中生成的信号大于在糖
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磷酸主链上具有相同核碱基序列的多个参考检测探针。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测探针的静电负性低于所述参考检测探针。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述检测探针直接或间接地偶联至可检测标记、任选地荧光标记。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述检测探针与所述靶标序列直接杂交。5.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述检测探针与和所述靶标序列直接或间接地结合的中间探针杂交。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述检测探针与和所述靶标序列直接杂交的中间探针直接杂交。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中所述检测探针包括单链区域和任选地双链区域。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中所述合成主链上的所述核碱基序列为第一探针序列，并且所述检测探针还包含在糖
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磷酸主链上包含核碱基的第二探针序列。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一探针序列位于所述第二探针序列的5
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或3
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处。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述检测探针包含一个或更多个第一探针序列和/或一个或更多个第二探针序列。11.根据权利要求8
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10中任一项所述的方法，其中所述第二探针序列为DNA序列、RNA序列或其组合。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中所述检测探针以任何合适的次序和组合包含核碱基A、T、C、G或U或它们的变体。13.根据权利要求1
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12中任一项所述的方法，其中所述检测探针的长度在约5至约50个核碱基之间。14.根据权利要求1
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13中任一项所述的方法，其中所述检测探针在所述合成主链中包含磷酰二胺键。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中所述检测探针在所述合成主链中包含吗啉环。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的方法，其中所述检测探针为吗啉代物。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中所述检测探针是不带电荷的或带正电荷的。18.根据权利要求1
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17中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体包含一个或更多个条形码序列，任选地其中所述靶标序列包含对应于所述生物样品中的分析物的条形码序列。19.根据权利要求1
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18中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体为所述生物样品中的
内源性核酸分子的延伸产物、复制产物、逆转录产物和/或扩增产物。20.根据权利要求1
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18中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体为与所述生物样品中的分析物直接或间接地结合的标记剂的延伸产物、复制产物、逆转录产物和/或扩增产物。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述标记剂包含报告寡核苷酸，任选地其中所述报告寡核苷酸包含一个或更多个条形码序列并且所述DNA多联体包含所述一个或更多个条形码序列的一个或多个拷贝。22.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体为与所述生物样品中的DNA或RNA分子杂交的环状或可环化探针或探针组的滚环扩增(RCA)产物。23.根据权利要求22所述的方法，其中分析由多个不同的mRNA和/或cDNA分子生成的DNA多联体，特定的环状或可环化探针或探针组中的条形码序列唯一地对应于特定的mRNA或cDNA分子，并且所述特定的环状或可环化探针或探针组还包含锚定序列，所述锚定序列在用于所述多个不同mRNA和/或cDNA分子的子集的环状或可环化探针或探针组中是共有的。24.根据权利要求20
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23中任一项所述的方法，其中所述标记剂包含与所述生物样品中的非核酸分析物直接或间接地结合的结合部分，并且所述标记剂中的所述报告寡核苷酸鉴别所述结合部分和/或所述非核酸分析物。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述标记剂的所述结合部分包含与蛋白质分析物直接或间接地结合的抗体或其抗原结合片段，并且所述DNA多联体为与所述标记剂的报告寡核苷酸杂交的环状或可环化探针或探针组的滚环扩增(RCA)产物。26.根据权利要求1
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25中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体呈纳米球的形式，所述纳米球的直径在约0.1μm至约3μm之间，例如约0.1μm至约0.5μm之间、约0.5μm至约1μm之间、约0.8μm至约1.3μm之间、或约1μm至约1.5μm之间。27.根据权利要求1
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26中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体的长度在约1至约15千碱基之间、约15至约25千碱基之间、约25至约35千碱基之间、约35至约45千碱基之间、约45至约55千碱基之间、约55至约65千碱基之间、约65至约75千碱基之间、或超过75千碱基。28.根据权利要求1
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27中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体包含所述靶标序列的约10至约100个之间、约100至约1,000个之间、约1,000至约5,000个之间、约5,000至约10,000个之间、或超过10,000个拷贝。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述DNA多联体中的所述靶标序列的至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％的拷贝与所述多个检测探针的一个或更多个分子直接或间接地结合。30.根据权利要求1
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29中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体原位生成。31.根据权利要求1
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30中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体固定在所述生物样品中。32.根据权利要求1
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31中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体与所述生物样品中的一个或更多个其他分子交联。33.根据权利要求1
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32中任一项所述的方法，其中在所述生物样品中原位检测包含所述检测探针的多个分子的复合物。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述方法包括任选地使用荧光显微术对所述生
物样品成像以检测所述复合物。35.根据权利要求1
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34中任一项所述的方法，其中在所述生物样品中原位分析所述DNA多联体分子的序列。36.根据权利要求1
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35中任一项所述的方法，其中所述检测探针用于通过顺序杂交、边杂交边测序、边连接边测序、边合成边测序、边结合边测序或其组合来分析所述DNA多联体的序列。37.根据权利要求35或36所述的方法，其中待分析的序列包括对应于所述生物样品中的分析物或其一部分的条形码序列。38.根据权利要求1
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37中任一项所述的方法，所述方法还包括去除一个或更多个未与所述靶标序列结合的所述检测探针的分子。39.根据权利要求1
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33中任一项所述的方法，其中所述多个检测探针的所述检测探针为第一检测探针，并且所述方法还包括在使所述生物样品与在合成主链上包含核碱基序列的多个第二检测探针接触之前，去除与所述靶标序列结合的所述第一检测探针的分子。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述靶标序列为第一靶标序列，并且所述多个第二检测探针中的第二检测探针与所述DNA多联体中的第二靶标序列直接或间接地结合，其中所述第一靶标序列和第二靶标序列相同或不同。41.根据权利要求1
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33中任一项所述的方法，其中所述检测探针为第一检测探针并且与第一中间探针杂交，所述第一中间探针与所述靶标序列杂交，任选地其中所述第一中间探针在合成主链上包含核碱基序列。42.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法还包括去除与所述靶标序列结合的所述第一检测探针和/或所述第一中间探针的分子。43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述方法还包括使所述生物样品与在合成主链上包含核碱基序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：一零X基因组学有限公司，
类型：发明
国别省市：