【技术实现步骤摘要】
一种高特异性的检测靶核酸序列的方法
[0001]本申请涉及核酸分子的多重检测。特别地，本申请提供了一种检测靶核酸序列的方法，所述方法能够以高特异性同时检测多种靶核酸序列在样品中的存在。此外，本申请还提供了一种探针组，和包含一种或多种所述探针组的试剂盒，所述探针组和试剂盒可用于实施本专利技术的方法。
技术介绍
[0002]实时荧光PCR是核酸检测的一种常用方法，其操作简便，应用广泛，同时作为一种闭管检测模式，扩增产物污染机会低，利用多重实时PCR可在单个反应管内同时检测多个靶序列，不仅检测效率提高，成本也进一步降低。
[0003]实时荧光PCR的检测原理基于荧光标记的寡核苷酸探针特异地与引物之间的靶序列结合，能避免引物二聚体等非特异扩增产生的干扰信号，确保检测结果的特异性。在多重实时PCR中，使用不同荧光基团标记与靶序列特异结合的探针，就可以通过检测探针的不同荧光信号识别相应的靶序列。在检测模式选择上，实时检测模式除扩增外无其他步骤，简便直接，但此种模式能检测的最大靶序列数目受限于荧光实时PCR仪器的荧光检测通道数，一般不超过6个。另一种检测模式是扩增后的熔解曲线分析，该模式是在扩增后增加一个变温过程，可检测的最大靶序列数目等于在荧光检测通道数目的基础上增加了探针与靶序列之间的熔点这个维度，相对于实时检测模式大大提高。
[0004]现阶段，无论采用何种检测模式，基于荧光探针检测的多重实时PCR都存在一些问题，一方面，荧光标记探针的制备涉及复杂的化学修饰和纯化过程，其成本大大高于非标记探针，其中，双标记探...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测n种靶核酸序列在样品中的存在的方法，其中，n为≥1的整数(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数)，并且，所述方法包括以下步骤：(1)针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列和一种媒介子探针；其中，所述上游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，所述媒介子探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列互补的序列，并且，所述靶特异性序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的上游；并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；其中，至少一种媒介子探针自身能够形成发夹结构；优选地，所述至少一种媒介子探针具有选自下列的特征：(i)所述媒介子探针在其靶特异性序列的下游或3'端还包含第一发夹形成序列，所述第一发夹形成序列与所述媒介子探针的媒介子序列或其部分互补，由此，所述媒介子探针能够通过所述媒介子序列和所述第一发夹形成序列形成发夹结构；(ii)所述媒介子探针在其媒介子序列的上游或5'端还包含第二发夹形成序列，所述第二发夹形成序列与所述媒介子探针的靶特异性序列或其部分互补，由此，所述媒介子探针能够通过所述第二发夹形成序列和所述靶特异性序列形成发夹结构；(iii)所述媒介子探针在其媒介子序列的上游或5'端还包含第三发夹形成序列，且在其靶特异性序列的下游或3'端还包含第四发夹形成序列，且所述第三发夹形成序列或其部分与所述第四发夹形成序列或其部分互补，由此，所述媒介子探针能够通过所述第三发夹形成序列和所述第四发夹形成序列形成发夹结构；并且，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列和媒介子探针接触；(2)在允许切割媒介子探针的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的酶接触；(3)提供m种检测探针，并且在允许核酸杂交的条件下，将步骤(2)的产物与所述m种检测探针接触，其中，m为大于0的整数，并且，每一种检测探针各自独立地从3'至5'方向包含，与一种或多种媒介子序列或其部分互补的一种或多种捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述m种检测探针包含至少n种捕获序列，其分别与步骤(1)中提供的n种媒介子探针的媒介子序列或其部分互补；并且，每一种检测探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，每一种检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；并且，(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触；(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定所述n种靶核酸序列是否存在于所述样品中。2.权利要求1的方法，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：
(a)m为小于等于n且大于0的整数；(b)m为≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥8、≥10的整数(例如，m为1、2、3、4、5或6)；优选地，当m≥2时，所述m种检测探针各自标记有不同的报告基团；(c)步骤(1)提供了至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种媒介子探针；并且，步骤(3)提供了至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、或至少10种检测探针；(d)至少1种，至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，至少10种，至少20种，至少30种，至少40种，至少45种媒介子探针各自独立地能够形成发夹结构，例如各自独立地具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)；(e)每一种媒介子探针各自独立地能够形成发夹结构，例如各自独立地具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)；(f)所述第一、第二、第三或第四发夹形成序列的长度各自独立地为5
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140nt，例如5
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10nt，10
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20nt，20
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30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
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60nt，60
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70nt，70
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80nt，80
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90nt，90
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100nt，100
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110nt，110
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120nt，120
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130nt，130
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140nt；(g)所述m种检测探针包含相同的报告基团；并且，在步骤(5)中，对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析，并根据所获得的熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一种靶核酸序列的存在；(h)所述m种检测探针所包含的报告基团彼此不同；并且，在步骤(5)中，在对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析时，分别实时监测每一种报告基团的信号，由此获得各自与一种报告基团的信号对应的多条熔解曲线；随后，根据报告基团的信号种类以及熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一种靶核酸序列的存在；(i)所述媒介子探针的靶特异性序列与第一发夹形成序列之间还含有连接体；优选地，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)；(j)所述媒介子探针的第二发夹形成序列与媒介子序列之间还含有连接体；优选地，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)；(k)所述媒介子探针的第三发夹形成序列与媒介子序列之间还含有连接体；优选地，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)；(l)所述媒介子探针的靶特异性序列与第四发夹形成序列之间还含有连接体；优选地，所述连接体包含1个或多个核苷酸(例如，1个，2个，3个，4个，5个，8个，10个，或更多个核苷酸)；(m)所述第一发夹形成序列与所述媒介子序列完全互补或部分互补；(n)所述第二发夹形成序列与所述靶特异性序列完全互补或部分互补；(o)所述第三发夹形成序列与所述第四发夹形成序列完全互补或部分互补；(q)所述媒介子探针能够通过所述媒介子序列和所述第一发夹形成序列、或者所述第二发夹形成序列和所述靶特异性序列、或者所述第三发夹形成序列和所述第四发夹形成序
列形成发夹结构，其中，所述发夹结构的臂具有平末端，或者所述臂具有5
’
悬突(例如，其5
’
端具有至少1个，至少2个，或者更多个游离碱基)，或者所述臂具有3
’
悬突(例如，其3
’
端具有至少1个，至少2个，或者更多个游离碱基)。3.权利要求1或2的方法，其中，m＝1，并且n为≥1的整数(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的整数)；优选地，所述方法包括下述步骤：(1)针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列和一种媒介子探针；其中，所述上游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，所述媒介子探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列互补的序列，并且，所述靶特异性序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的上游；并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；其中，至少一种媒介子探针自身能够形成发夹结构；例如，所述至少一种媒介子探针具有权利要求1中定义的特征(i)，(ii)或(iii)；并且，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列和媒介子探针接触；(2)在允许切割媒介子探针的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的酶接触；(3)在允许核酸杂交的条件下，将步骤(2)的产物与一种检测探针接触，所述检测探针从3'至5'方向包含，与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触；(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定所述n种靶核酸序列是否存在于所述样品中。4.权利要求1
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3任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(a)所述样品包含或是DNA，或RNA，或核酸的混合物；(b)所述靶核酸序列是DNA或RNA；和/或，所述靶核酸序列是单链的或双链的；(c)所述样品或靶核酸序列获自选自下列的来源：原核生物，真核生物，病毒或类病毒。(d)所述媒介子探针包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；(e)所述媒介子探针的长度为15
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150nt，例如15
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20nt，20
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30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
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60nt，60
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70nt，70
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80nt，80
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90nt，90
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100nt，100
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110nt，110
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120nt，120
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130nt，130
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140nt，140
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150nt；(f)所述媒介子探针中的靶特异性序列的长度为10
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140nt，例如10
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20nt，20
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30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
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60nt，60
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70nt，70
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80nt，80
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90nt，90
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100nt，100
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110nt，110
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120nt，120
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130nt，130
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140nt；(g)所述媒介子探针中的媒介子序列的长度可以为5
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140nt，例如5
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10nt，10
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20nt，20
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30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
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60nt，60
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70nt，70
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80nt，80
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90nt，90
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100nt，100
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110nt，110
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120nt，120
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130nt，130
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140nt；(h)所述媒介子探针具有3'
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OH末端，或者其3'
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末端是封闭的；(i)所述上游寡核苷酸序列包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；(j)所述上游寡核苷酸序列的长度为15
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150nt，例如15
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20nt，20
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30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
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60nt，60
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70nt，70
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80nt，80
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90nt，90
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100nt，100
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110nt，110
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120nt，120
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130nt，130
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140nt，140
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150nt；(k)所述上游寡核苷酸序列在与靶核酸序列杂交后，位于媒介子探针的上游远端，或位于媒介子探针的上游邻近，或与媒介子探针的靶特异性序列具有部分重叠的序列；和(l)所述上游寡核苷酸序列为特异于靶核酸序列的引物或者特异于靶核酸序列的探针。5.权利要求1
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4任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(a)在步骤(2)中，所述具有5'核酸酶活性的酶切割与靶核酸序列杂交的媒介子探针，并释放出包含完整媒介子序列或者媒介子序列的一部分(5'
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末端部分)的媒介子片段；(b)所述具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性(例如5'外切核酸酶活性)的核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶)；优选地，所述DNA聚合酶获自选自下列的细菌：Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Ther...
【专利技术属性】
技术研发人员：李庆阁，杜琛，廖逸群，许晔，周淑娟，宋甲宝，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：
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