经改进的核酸靶标富集和相关方法技术

本发明专利技术是一种经改进的靶标富集和靶标耗尽方法，其中探针结合由FANCA蛋白促进。通过使用所述FANCA蛋白，改进用于涉及核酸探针杂交的下一次再生测序和相关方法的经改进的工作流程。流程。流程。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经改进的核酸靶标富集和相关方法


[0001]本专利技术涉及核酸测序领域，更具体地，涉及用于高通量单分子核酸测序的靶标富集。

技术介绍

[0002]高通量测序技术在研究和临床中不断发现新的用途。现代方法能够以逐渐降低的成本对生物体的整个基因组进行测序。许多测序应用仅关注基因组的一部分或样品中存在的所有核酸的子集。靶标富集方法捕获并任选地扩增所需的核酸以进行测序。现有的靶标富集方法需要大量不同的单链DNA(ssDNA)探针的杂交，以便捕获和富集目标序列。通常，将DNA样品与合成的带标签的DNA探针接触，然后对退火的双链体进行亲和纯化。该过程可能是低效、不精确且耗时的。在高度多样化的捕获池中，链退火的特征在于慢动力学，使得杂交反应通常需要长的孵育期，但结果仍然是仅能捕获一小部分所需的靶标。当前的方法还存在非特异性捕获脱靶序列的问题，导致目标序列的表现减小。因此，非常需要提高DNA富集测定的效率和准确性的方法。
[0003]对范可尼贫血(FA)患者的双链断裂修复(DBR)通路缺陷的研究已经使得鉴定出多种FA互补群蛋白(FANC蛋白)。这些蛋白用于单链退火断裂修复通路，其中将在断裂的任一侧的末端处的5
′
链切除，然后将单链3
′
末端上的互补重复序列退火、加工以及通过连接酶闭合。Benitez等人(2018)FANCA promotes DNA double
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strand break repair by catalyzing single
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strand annealing and strand exchange，Molecular Cell 71：621。八种FANC家族成员蛋白参与了核心复合物，包括范可尼贫血互补群A(FANCA)，它是FA患者中最常见的突变蛋白。FANCA最近已被证明在体外表现出高水平的单链DNA链退火(SA)和链交换(SE)活性。包括RAD52家族蛋白在内的附加蛋白有助于在FANCA与核酸链之间形成复合物，参见Van den Bosch等人(2002)DNA double strand break repair by homologous recombination，Biol.Chem.383∶873。

技术实现思路

[0004]本专利技术教导了通过在范可尼贫血互补群A(FANCA)蛋白的存在下进行杂交反应来改进核酸杂交。包括核酸杂交步骤的任何方法都可以通过本文公开的改进来得到增强，包括但不限于通过探针杂交进行的靶标捕获或靶标检测、靶标复制或靶标扩增、靶标测序工作流程和体外重组方法(诸如CRSPR方法)。
[0005]在一些实施例中，本专利技术是用于捕获靶核酸序列的方法，所述方法包括：形成反应混合物，所述反应混合物包含核酸样品(所述核酸样品可包含或可不包含一种或多种靶序列)、至少部分地与所述一种或多种靶序列互补的多种寡核苷酸探针、以及范可尼贫血互补群A(FANCA)蛋白；在其中一种或多种靶序列与多种探针之间的杂交由FANCA蛋白催化以形成多种靶标
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探针杂交体的条件下孵育反应混合物。核酸样品可包含基因组DNA或RNA靶序列。所述靶序列中的至少一种可包括单核苷酸多态性(SNV)或基因组拷贝数变异(CNV)。
[0006]在一些实施例中，多种探针包括缀合至捕获部分诸如生物素的探针。在一些实施例中，探针附着于底物。在一些实施例中，底物包含用于捕获部分的配体，诸如亲和素或链霉亲和素。在一些实施例中，底物是微粒或微阵列载玻片。在一些实施例中，杂交发生在固相上。
[0007]在一些实施例中，多种探针包含探询核苷酸。
[0008]在一些实施例中，反应混合物进一步包含RAD52蛋白或FANCG蛋白。
[0009]在一些实施例中，所述方法进一步包括从反应混合物中分离靶标
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探针杂交体，从靶标
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探针杂交体中释放靶标，并通过测序或检测可检测的标记诸如荧光标记来检测所述释放的靶核酸序列。
[0010]在一些实施例中，本专利技术是用于序列特异性核酸捕获的组合物，所述组合物包含一种或多种寡核苷酸探针和范可尼贫血互补群A(FANCA)蛋白。
[0011]在一些实施例中，本专利技术是用于捕获核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种寡核苷酸探针和范可尼贫血互补群A(FANCA)蛋白。所述试剂盒可进一步包括RAD52蛋白或FANCG蛋白。
[0012]在一些实施例中，捕获探针进一步包含检测部分，例如荧光部分。
[0013]在一些实施例中，本专利技术是复制靶核酸序列的方法，所述方法包括：形成反应混合物，所述反应混合物包含核酸样品(所述核酸样品可包含或可不包含一种或多种靶序列)、至少部分地与一种或多种靶序列互补的至少一种寡核苷酸引物、以及范可尼贫血互补群A(FANCA)蛋白；在其中一种或多种靶序列与至少一种引物之间的杂交由FANCA蛋白催化的条件下孵育反应混合物，延伸至少一种引物从而复制一种或多种靶序列。
[0014]在一些实施例中，本专利技术是扩增靶核酸序列的方法，所述方法包括：形成反应混合物，所述反应混合物包含核酸样品(所述核酸样品可包含或可不包含一种或多种靶序列)、至少部分地与一种或多种靶序列互补的至少一对正向和反向寡核苷酸引物、以及范可尼贫血互补群A(FANCA)蛋白；在其中一种或多种靶序列与至少一对正向和反向寡核苷酸引物之间的杂交由FANCA蛋白催化的条件下孵育反应混合物，在引物延伸、变性、引物杂交和引物延伸的一系列循环中延伸至少一对正向和反向寡核苷酸引物从而扩增一种或多种靶序列。
[0015]在一些实施例中，本专利技术是一种从样品中选择性地耗尽核酸的方法，所述方法包括：使所述样品与一种或多种寡核苷酸探针及范可尼贫血互补群A(FANCA)蛋白接触，所述一种或多种寡核苷酸探针至少部分地与待耗尽的核酸互补；在其中待耗尽的核酸与寡核苷酸探针之间的杂交由FANCA蛋白催化的条件下孵育样品；从样品中去除在步骤b)中形成的复合物。待耗尽序列可以是选自人类LINE和SINE、核糖体或线粒体RNA或DNA或珠蛋白基因或cDNA序列的重复序列。
附图说明
[0016]图1描绘了表现出其链退火(SA)活性的FANCA蛋白的二聚体。
[0017]图2描绘了表现出其链交换(SE)活性的FANCA蛋白的二聚体。
[0018]图3示出了示例性测序工作流程，其中通过添加FANCA蛋白改进了一个或多个步骤。
具体实施方式
[0019]定义
[0020]以下定义辅助理解本公开。
[0021]术语“样品”是指任何含有或假定含有靶核酸的组合物。这包括从个体分离的组织或液体的样品，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血液细胞、器官和肿瘤，也指从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品，包括福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)和自其分离的核酸。样品也可包括不含细胞的材料，诸如含有无细胞DNA(cfDNA)或循环肿瘤D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种捕获靶核酸序列的方法，所述方法包括：a)形成反应混合物，其包含：i)核酸样品，所述核酸样品可包含或可不包含一种或多种靶序列，ii)一种或多种寡核苷酸探针，所述一种或多种寡核苷酸探针至少部分地与所述一种或多种靶序列互补，以及iii)范可尼贫血互补群A(FANCA)蛋白；b)在其中所述一种或多种靶序列与多种探针之间的杂交由所述FANCA蛋白催化以形成多种靶标
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探针杂交体的条件下孵育所述反应混合物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸样品包含基因组DNA。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸样品包含RNA靶序列。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶序列中的至少一种包括单核苷酸多态性(SNV)。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶序列中的至少一种包括基因组拷贝数变异(CNV)。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种探针包括缀合至捕获部分的探针。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针附着于底物。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种探针包含探询核苷酸。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物进一步包括RAD52蛋白或FANCG蛋白。10.一种用于序列特异性核酸捕获的组合物，所述组合物包含一种或多种寡核苷酸探针和范可尼贫血互补群A(FANCA)蛋白。11.一种用于捕获核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种寡核苷酸探针和范可尼贫血互补群A(FANCA)蛋白。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获探针进一步包含检测部分。13.一种复制靶核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：豪夫迈，
类型：发明
国别省市：