核酸杂交方法技术

技术编号:32098815 阅读:16 留言:0更新日期:2022-01-29 18:34
描述了在杂交特异性、速率和效率方面产生改进的核酸杂交缓冲液制剂及其用途。缓冲液制剂组合物包含靶核酸;至少一种极性非质子有机溶剂和pH缓冲液体系,其中靶核酸通过与束缚于表面的表面结合核酸杂交而附接于表面,并且其中靶核酸与表面结合核酸的杂交具有较高的严格性和退火速率。格性和退火速率。格性和退火速率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸杂交方法
交叉引用
[0001]本申请是2019年8月16日提交的美国专利申请第16/543,351号的部分继续申请,该部分继续申请要求2019年5月1日提交的美国临时申请第62/841,541号的权益,其各自的全部内容通过引用并入本文。

技术介绍

[0002]本文的公开内容涉及分子生物学领域,例如用于核酸杂交的组合物、方法和系统。特别地,其涉及用于附接于表面的核酸的杂交组合物和方法。
[0003]核酸杂交方案构成许多不同核酸扩增和分析技术的重要部分。通过使用现有核酸杂交方案实现的有限特异性和反应速率可能对下游核酸分析方法的通量和准确性产生不利影响。严格性控制的方法通常涉及导致杂交复合物数量显著减少的条件。因此,需要一种改进的方法来在测序分析过程中实现高度严格性的杂交。

技术实现思路

[0004]本文提供了用于将靶核酸分子附接至表面的方法,该方法包括:在足以使所述靶核酸分子在小于30分钟的时间段内被捕获探针捕获的条件下使包含浓度为1纳摩尔或更低的所述靶核酸分子的混合物与包含与其偶联的所述捕获探针的亲水表面接触。
[0005]在一些实施方案中,所述混合物包含极性非质子溶剂。在一些实施方案中,极性非质子溶剂包含甲酰胺。在一些实施方案中,所述捕获探针是核酸分子。在一些实施方案中,所述浓度为0.50纳摩尔或更小。在一些实施方案中,所述浓度为250皮摩尔或更小。在一些实施方案中,所述浓度为100皮摩尔或更小。在一些实施方案中,所述时间段小于或等于20分钟。在一些实施方案中,所述时间段小于或等于15分钟。在一些实施方案中,所述时间段小于或等于10分钟。在一些实施方案中,所述时间段小于或等于5分钟。
[0006]在一些实施方案中,所述亲水表面保持在约30摄氏度至约70摄氏度的温度下。在一些实施方案中,所述亲水表面保持在基本恒定的温度下。在一些实施方案中,方法进一步包括以与可比杂交反应(comparable hybridization reaction)相比增加的杂交效率将靶核酸分子与捕获探针杂交,所述可比杂交反应在包含盐水

柠檬酸钠的缓冲液组合物中进行120分钟,在90摄氏度下5分钟,随后冷却120分钟以达到37摄氏度的最终温度。在一些实施方案中,方法进一步包括以至少80%的杂交严格性将靶核酸分子与捕获探针杂交。
[0007]在一些实施方案中,亲水表面表现出小于约0.25个分子/平方微米的非特异性花青3染料吸附水平。在一些实施方案中,混合物进一步包含pH缓冲液,其包含2

(N

吗啉代)乙磺酸、乙腈、3

(N

吗啉代)丙磺酸、甲醇或其组合。在一些实施方案中,混合物进一步包含选自聚乙二醇、葡聚糖、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羟甲基纤维素及其任意组合的群集剂(crowding agent)。在一些实施方案中,亲水表面包含一个或多个亲水聚合物层。在一些实施方案中,一个或多个亲水聚合物层包含选自以下的分子:聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯
基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N

异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2

羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素和葡聚糖。在一些实施方案中,一个或多个亲水聚合物层包含至少一种树枝状聚合物。
[0008]本文提供了用于将靶核酸分子与偶联至亲水聚合物表面的核酸分子杂交的方法,该方法包括:(a)提供偶联至亲水聚合物表面的至少一种核酸分子;和(b)在足以使所述靶核酸分子与偶联至聚合物表面的至少一种核酸分子在30分钟或以内杂交的条件下,使偶联至聚合物表面的至少一种核酸分子与包含浓度为1纳摩尔或更低的靶核酸分子的杂交组合物接触。在一些实施方案中,所述条件保持在基本恒定的温度下。
[0009]在一些实施方案中,亲水聚合物表面具有小于45度的水接触角。在一些实施方案中,靶核酸分子以0.50纳摩尔或更低的浓度存在于杂交组合物中。在一些实施方案中,靶核酸分子以250皮摩尔或更低的浓度存在于杂交组合物中。在一些实施方案中,靶核酸分子以100皮摩尔或更低的浓度存在于杂交组合物中。在一些实施方案中,使偶联至聚合物表面的至少一种核酸分子与杂交组合物接触被进行小于30分钟的时间段。在一些实施方案中,该时间段小于20分钟。在一些实施方案中,该时间段小于15分钟。在一些实施方案中,该时间段小于10分钟。在一些实施方案中,该时间段小于5分钟。
[0010]在一些实施方案中,方法进一步包括以与可比杂交反应相比增加的杂交效率将靶核酸分子与偶联至聚合物表面的至少一种核酸分子杂交,所述可比杂交反应在包含盐水

柠檬酸钠的缓冲液中进行120分钟,在90摄氏度下5分钟,随后冷却120分钟以达到37摄氏度的最终温度。在一些实施方案中,温度为约30摄氏度至70摄氏度。在一些实施方案中,温度为约50摄氏度。在一些实施方案中,方法进一步包括以至少80%的杂交严格性将靶核酸分子与至少一种核酸分子杂交。在一些实施方案中,亲水聚合物表面表现出小于约0.25个分子/平方微米的非特异性花青3染料吸附水平。
[0011]在一些实施方案中,杂交组合物进一步包含:(a)在68华氏度下测量时具有不大于约115的介电常数的至少一种有机溶剂;和(b)pH缓冲液。在一些实施方案中,杂交组合物进一步包含:(a)极性且非质子的至少一种有机溶剂;和(b)pH缓冲液。在一些实施方案中,至少一种有机溶剂包含至少一种选自羟基、腈、内酯、砜、亚硫酸根和碳酸根的官能团。在一些实施方案中,至少一种有机溶剂包含甲酰胺。在一些实施方案中,至少一种有机溶剂可与水混溶。在一些实施方案中,基于杂交组合物的总体积,至少一种有机溶剂为至少约5体积百分比(%by volume)。在一些实施方案中,基于杂交组合物的总体积,至少一种有机溶剂为至多约95体积百分比。
[0012]在一些实施方案中,pH缓冲液为杂交组合物的总体积的至多约90体积百分比。在一些实施方案中,pH缓冲液包含2

(N

吗啉代)乙磺酸、乙腈、3

(N

吗啉代)丙磺酸、甲醇或其组合。在一些实施方案中,pH缓冲液进一步包含第二有机溶剂。在一些实施方案中,pH缓冲液以有效将杂交组合物的pH维持在约3至约10的范围内的量存在于杂交组合物中。
[0013]在一些实施方案中,杂交组合物进一步包含分子群集剂。在一些实施方案中,分子群集剂选自聚乙二醇、葡聚糖、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羟甲基纤维素及其任意组合。在一些实施方案中,分子群集剂是聚乙二醇。在一些实施本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于将靶核酸分子与偶联至亲水聚合物表面的核酸分子杂交的方法,所述方法包括:(a)提供偶联至亲水聚合物表面的至少一种核酸分子;和(b)在足以使所述靶核酸分子与偶联至所述聚合物表面的所述至少一种核酸分子在30分钟或以内杂交的条件下,使偶联至所述聚合物表面的所述至少一种核酸分子与包含浓度为1纳摩尔或更低的所述靶核酸分子的杂交组合物相接触。2.根据权利要求1所述的方法,其中所述亲水聚合物表面具有小于45度的水接触角。3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述条件保持在基本恒定的温度下。4.根据权利要求3所述的方法,其中所述靶核酸分子以0.50纳摩尔或更低的浓度存在于所述杂交组合物中。5.根据权利要求4所述的方法,其中所述靶核酸分子以250皮摩尔或更低的浓度存在于所述杂交组合物中。6.根据权利要求5所述的方法,其中所述靶核酸分子以100皮摩尔或更低的浓度存在于所述杂交组合物中。7.根据权利要求1

4中任一项所述的方法,其中在小于30分钟的时间段内进行使偶联至所述聚合物表面的所述至少一种核酸分子与所述杂交组合物相接触。8.根据权利要求7所述的方法,其中所述时间段小于20分钟。9.根据权利要求8所述的方法,其中所述时间段小于15分钟。10.根据权利要求9所述的方法,其中所述时间段小于10分钟。11.根据权利要求10所述的方法,其中所述时间段小于5分钟。12.根据权利要求1

11中任一项所述的方法,进一步包括以与可比杂交反应相比增加的杂交效率将所述靶核酸分子与偶联至所述聚合物表面的所述至少一种核酸分子杂交,所述可比杂交反应在包含盐水

柠檬酸钠的缓冲液中进行120分钟,在90摄氏度下5分钟,随后冷却120分钟以达到37摄氏度的最终温度。13.根据权利要求1

12中任一项所述的方法,其中所述温度为约30摄氏度至70摄氏度。14.根据权利要求13所述的方法,其中所述温度为约50摄氏度。15.根据权利要求1

14中任一项所述的方法,进一步包括以至少80%的杂交严格性将所述靶核酸分子与所述至少一种核酸分子杂交。16.根据权利要求1

15中任一项所述的方法,其中所述亲水聚合物表面表现出小于约0.25个分子/平方微米的非特异性花青3染料吸附水平。17.根据权利要求1

16中任一项所述的方法,其中所述杂交组合物进一步包含:(a)在68华氏度下测量时具有不大于约115的介电常数的至少一种有机溶剂;和(b)pH缓冲液。18.根据权利要求1

16中任一项所述的方法,其中所述杂交组合物进一步包含:(a)极性且非质子的至少一种有机溶剂;和(b)pH缓冲液。19.根据权利要求17或18所述的方法,其中所述至少一种有机溶剂包含至少一种选自羟基、腈、内酯、砜、亚硫酸根和碳酸根的官能团。20.根据权利要求19所述的方法,其中所述至少一种有机溶剂包含甲酰胺。
21.根据权利要求17或18所述的方法,其中所述至少一种有机溶剂可与水混溶。22.根据权利要求17或18所述的方法,其中基于所述杂交组合物的总体积,所述至少一种有机溶剂为至少约5体积百分比。23.根据权利要求22所述的方法,其中基于所述杂交组合物的总体积,所述至少一种有机溶剂为至多约95体积百分比。24.根据权利要求17或18所述的方法,其中所述pH缓冲液为所述杂交组合物的总体积的至多约90体积百分比。25.根据权利要求17或18所述的方法,其中所述pH缓冲液包含2

(N

吗啉代)乙磺酸、乙腈、3

(N

吗啉代)丙磺酸、甲醇或其组合。26.根据权利要求17或18所述的方法,其中所述pH缓冲液进一步包含第二有机溶剂。27.根据权利要求17或18所述的方法,其中所述pH缓冲液以有效将所述杂交组合物的pH维持在约3至约10的范围内的量存在于所述杂交组合物中。28.根据权利要求1

27中任一项所述的方法,其中所述杂交组合物进一步包含分子群集剂。29.根据权利要求28所述的方法,其中所述分子群集剂选自聚乙二醇、葡聚糖、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羟甲基纤维素及其任意组合。30.根据权利要求29所述的方法,其中所述分子群集剂是聚乙二醇。31.根据权利要求28

30中任一项所述的方法,其中所述分子群集剂具有在约5,000至40,000道尔顿范围内的分子量。32.根据权利要求28

31中任一项所述的方法,其中基于所述杂交组合物的总体积,所述分子群集剂的量为至少约5体积百分比。33.根据权利要求28

32中任一项所述的方法,其中基于所述杂交组合物的总体积,所述分子群集...

【专利技术属性】
技术研发人员:锡南
申请(专利权)人:元素生物科学公司
类型:发明
国别省市:

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