一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂及其应用。本发明专利技术提供的封闭序列与PCR Primer序列反向互补，且采用锁核苷酸修饰。封闭序列3

【技术实现步骤摘要】
一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂及其应用。

技术介绍

[0002]近十几年来，NGS(二代测序技术)的快速发展使得DNA测序成本大幅降低，然而就现阶段而言，全基因组重测序的成本依然很高，且得到的海量数据分析速度缓慢，无法大规模地应用。
[0003]靶向测序技术可以将感兴趣的基因组区域富集出来进行测序，通过对几十个、或者几百个基因的深度测序，找出突变。单个样本测序数据产出少且分析速度较快，因此更能经济高效地发挥NGS技术的优势，广泛应用到临床检测、健康筛查等众多领域。另外，靶向测序可以对目标区域进行深度测序，增加了目标区域内遗传变异的检测灵敏度和准确性，在低频突变位点的检出方面有很大优势。
[0004]在靶向捕获流程中，需要结合不同变异类型，对靶区DNA序列设计序列探针，同时在探针的末端加上生物素标记。在液相杂交体系中，根据DNA碱基互补配对原理，使用生物素标记的探针将靶区序列捕获出来，然后利用链霉亲和素磁珠将探针及结合到探针上的靶区序列捕获下来，通过PCR扩增进一步富集，即得到NGS捕获后的文库。
[0005]对捕获后的文库进行NGS二代测序时，目前主要的测序平台有Illumina和MGI平台，其中Illumina平台技术较成熟，应用范围广泛。但是，随着近年来的迅速发展，华大智造(MGI)不断推出了更高测序通量的测序仪，从而测序成本不断降低，相继推出的MGI
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200、MGI
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2000和T7测序仪，其中T7测序仪是目前市场上测序通量最高和测序成本最低的测序仪。在测序通量、数据产出质量、测序周期以及测序价格等方面表现出了很大的优势，市场上越来越多的NGS建库试剂盒在MGI测序平台的基础上，已经开发出了单端index和双端index接头序列(包括UMI分子标签)，因此兼容MGI平台的靶向捕获试剂相关产品的开发也越来越重要。
[0006]由于文库构建过程中引入了大量的非靶区DNA序列，如重复序列、接头和标签序列等。这些序列又具有高度的相似性，会在杂交捕获过程中，干扰探针和靶区的结合，引入大量非特异性捕获，导致捕获效率降低。所以在靶向捕获过程中，需要将非靶区DNA序列进行封闭，阻断文库之间的串联反应发生，提高数据利用率。
[0007]在液相杂交捕获中，针对重复序列常用的封闭试剂为Human cot DNA或Salmon Sperm DNA，其中Human cot DNA主要用于人源样本中重复序列的封闭，Salmon Sperm DNA主要用于非人源样本中重复序列的封闭。
[0008]目前针对接头和标签序列等非目标序列的封闭采用的是对接头序列和标签序列同时进行封闭，有一对一和一对多两种封闭方法。一对一是指，每一种标签序列和接头序列都用其对应的互补序列进行封闭。常用的标签序列有6～8个碱基，则需要设计一一对应的封闭序列的种类要上万条。按照这个数量级来合成封闭序列所需成本较高。并且在建库过
程中，需要核对标签序列，一一找出其对应的封闭序列，增加了建库过程中实验操作的繁琐性，很容易出现人为识别错误，导致样本数据异常，消耗大量人力物力在问题排查上。一对多的封闭方式是指，对标签序列采用对应数目的次黄嘌呤占位。但是次黄嘌呤的合成价格昂贵，封闭效率不如一对一高。
[0009]在Blocker序列方面，目前市场上常用的Adaptor封闭序列选择封闭双链DNA的其中一条，序列保持与扩增时用到的PCR Primer序列部分相同(下文中我们称这种Blocker为正向序列。与PCR Primer序列反向互补的序列，我们称之为反向序列)，这种Blocker序列在PCR扩增时，很容易被当成引物参与到模板的PCR扩增，引起标签跳跃，给后续数据分析和结果解读带来影响，所以需要在Blocker的3
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端进行封闭修饰，比如MGB、C3间隔臂，磷酸化，地高辛或生物素双脱氧核苷酸等修饰。这样一来就增加了Blocker序列合成时的成本。

技术实现思路

[0010]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
[0011]本专利技术是这样实现的，一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂，封闭序列与PCR Primer序列反向互补，且采用锁核苷酸修饰。
[0012]进一步地，封闭序列3
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端封闭无需修饰；或3
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端进行MGB修饰、C3间隔臂修饰，磷酸化修饰，地高辛修饰或生物素修饰。
[0013]进一步地，通用封闭试剂针对MGI单端index文库，选自组合：
[0014]a)：
[0015]UM5B：AAGT+CGGAT+CGTAG+CCATGT+CGTTC；
[0016]UM7B：AGT+CGGAGGC+CAAG+CGGT+CTTAGGAAGA+CAAIIIIIIIIII+CAACTC+CTTGG+CT+CACA；
[0017]或b)：
[0018]M
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B
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S1：GAA+CGA+CATGG+CTACGAT+CCGACTT
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MGB；
[0019]M
‑
B
‑
S2：TGTGAGC+CAAGG+AGTTGIIIIIIIIIITTGT+CTTC+CTAAGA+CCGCTTGG+CCTCCGACTT
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MGB；
[0020]或c)：
[0021]M
‑
B
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S3：AAGT+CGGAT+CGTAG+CCATGT+CGTTC/3SpC3/；
[0022]M
‑
B
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S4：AGT+CGGAGGC+CAAG+CGGT+CTTAGGAAGA+CAAIIIIIIIIII+CAACTC+CTTGG+CT+CACA/3SpC3/；
[0023]或d)：
[0024]M
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B
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S5：GAA+CGA+CATGG+CTACGAT+CCGACTT/3SpC3/；
[0025]M
‑
B
‑
S6：TGTGAGC+CAAGG+AGTTGIIIIIIIIIITTGT+CTTC+CTAAGA+CCGCTTGG+CCTCCGACTT/3SpC3/；
[0026]其中，+表示锁核苷酸修饰，I表示次黄嘌呤，
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MGB表示MGB修饰，/3SpC3/表示Spacer C3修饰。
[0027]进一步地，通用封闭试剂针对MGI双端index文库，选自组合：
[0028]a)：
[0029]M
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B
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D1：CTCTC+AGTACGT+CA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂，其特征在于：封闭序列与PCR Primer序列反向互补，且采用锁核苷酸修饰。2.根据权利要求1所述的一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂，其特征在于：封闭序列3
’
端封闭无需修饰；或3
’
端进行MGB修饰、C3间隔臂修饰，磷酸化修饰，地高辛修饰或生物素修饰。3.根据权利要求1所述的一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂，其特征在于，通用封闭试剂针对MGI单端index文库，选自组合：a)：UM5B：AAGT+CGGAT+CGTAG+CCATGT+CGTTC；UM7B：AGT+CGGAGGC+CAAG+CGGT+CTTAGGAAGA+CAAIIIIIIIIII+CAACTC+CTTGG+CT+CACA；或b)：M
‑
B
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S1：GAA+CGA+CATGG+CTACGAT+CCGACTT
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MGB；M
‑
B
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S2：TGTGAGC+CAAGG+AGTTGIIIIIIIIIITTGT+CTTC+CTAAGA+CCGCTTGG+CCTCCGACTT
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MGB；或c)：M
‑
B
‑
S3：AAGT+CGGAT+CGTAG+CCATGT+CGTTC/3SpC3/；M
‑
B
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S4：AGT+CGGAGGC+CAAG+CGGT+CTTAGGAAGA+CAAIIIIIIIIII+CAACTC+CTTGG+CT+CACA/3SpC3/；或d)：M
‑
B
‑
S5：GAA+CGA+CATGG+CTACGAT+CCGACTT/3SpC3/；M
‑
B
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S6：TGTGAGC+CAAGG+AGTTGIIIIIIIIIITTGT+CTTC+CTAAGA+CCGCTTGG+CCTCCGACTT/3SpC3/；其中，+表示锁核苷酸修饰，I表示次黄嘌呤，
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MGB表示MGB修饰，/3SpC3/表示Spacer C3修饰。4.根据权利要求1所述的一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂，其特征在于，通用封闭试剂针对MGI双端index文库，选自组合：a)：M
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B
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D1：CTCTC+AGTACGT+CAGCAGTTIIIIIIIIIICAACTC+CTTGG+CTCACAGAA+CGACATGG+CTACGAT+CCGACTT
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MGB；M
‑
B
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D2：GCATGG+CGACCT+TATCAGIIIIIIIIIITTGT+CTTCCTAAGA+CCGCTTGG+CCTCCGACTT
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MGB；或b)：C
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯延叶，刘会珍，孙大坤，柴智，赖煦卉，孙大鹏，
申请(专利权)人：上海英基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：