可用于抗体定点偶联的融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种可用于抗体定点偶联的融合蛋白及其应用。本发明专利技术融合蛋白主要由改造的抗体Fc亲和蛋白结合单体avidin蛋白融合而成，实现抗体Fc亲和蛋白直接与带有biotin标记的分子偶联，不再使用点击化学方案，这样大大简化了抗体Fc亲和蛋白Protein G的生产与使用难度，生产中不再需要通过点击化学活化Protein G蛋白，运输储存条件不再受到严格控制，甚至可以实现一步法抗体分子偶联等。以实现一步法抗体分子偶联等。以实现一步法抗体分子偶联等。

【技术实现步骤摘要】
可用于抗体定点偶联的融合蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具有涉及一种可用于抗体定点偶联的融合蛋白及抗体定点偶联的方法和应用。

技术介绍

[0002]抗体偶联是指在抗体分子上进行化学物质(如小分子药物、核酸分子、荧光基团等)的修饰。抗体偶联的应用广泛，包括抗体药物偶联、流式抗体荧光偶联、单细胞标记抗体核酸偶联、抗原检测抗体偶联等。
[0003]抗体偶联技术主要分为非定向偶联和定点偶联两大类。其中，非定向抗体偶联一般采用点击化学方式，将功能性基团(小分子、核酸、蛋白等)连接到抗体的特定氨基酸残基上，如NH2、COOH、SH等。由于抗体上通常存在较多的NH2、COOH、SH等氨基酸残基位点，导致偶联发生位点不确定。
[0004]目前，定点抗体偶联技术主要有如下几种：
[0005]a)抗体序列引入非天然氨基酸作为定点活性基团，通过非天然氨基酸可以实现抗体与功能基团位点的特异性偶联。这类方案需要定向改造抗体序列，可用于抗体开发数量较少的ADC药物开发领域，不适合大规模货架抗体产品的定点偶联。
[0006]b)酶法偶联：通过一些特殊工具酶引入额外序列实现定向偶联位点，特殊工具酶如谷氨酰胺转移酶、分选酶StrA、甲酰甘氨酸生成酶、类异戊二烯转移酶等。然而这类方案在大规模货架抗体上使用受限，一些需要改造抗体序列、一些原因是效率较低等。
[0007]c)亲和偶联：通过一些定向亲和抗体的分子，如Protein A、Protein G、aptamer等，锚定在抗体Fc片段上，提供并实现定向偶联位点。这类方案可以在大规模货架抗体上使用，比较灵活。
[0008]目前，商业化的亲和偶联技术产品如AlphaThera Inc的oYo
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link抗体偶联技术，其核心是采用Protein G工程化改造蛋白，在Protein G蛋白上引入点击化学活性基团。oYo抗体偶联技术操作过程是，首先工程化改造的Protein G与抗体Fc定向结合，一个Fc片段可以结合一个或两个Protein G蛋白，然后活化的功能基团(如核酸、燃料等上带有Azide)与Protein G上点击化学活性基团(如DBCO)反应，从而实现定点偶联。
[0009]oYo
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link抗体偶联技术方案需要改造Protein G蛋白序列，通过酶法或化学法引入点击化学活性基团，因此在偶联反应期间需要优化控制点击化学物质浓度比例，偶联反应需要控制溶液试剂干扰，活化的Protein G运输保存及其使用必须严格控制保存条件与使用时间，否则Protein G蛋白上DBCO基团暴露在空气里发生快速氧化失效。
[0010]另外，JPWO2008130053A1提供了一种Fusion protein of protein G and avidins的融合方案，核心蛋白protein G采用野生型protein G蛋白，单体亲和素结合蛋白采用单体形式的链霉素亲和蛋白。JPWO2008130053A1为了降低protein G的非特异性结合，也采用了protein G蛋白子结构域区域，未做亲和力提高突变措施，这导致protein G蛋白的Fc亲和能力大大降低；JPWO2008130053A1采用的单体形式链霉素亲和蛋白也存在生物素
亲和下降困扰，Kd值降低到nM级别。DeMonte，Structure based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate，2013年发表了工程改造的单体形式链霉素亲和蛋白的Kd值在0.53～0.78nM。因此，有必要进一步探究能够提升应用效果的可用于抗体定点偶联的融合蛋白方案。

技术实现思路

[0011]基于此，有必要提供一种可用于抗体定点偶联的融合蛋白及抗体定点偶联的方法和应用，采用非点击化学方案，运输储存条件不再受到严格控制，使用快捷方便。
[0012]本专利技术采用如下技术方案：
[0013]本专利技术提供一种可用于抗体定点偶联的融合蛋白，所述融合蛋白主要由抗体Fc亲和蛋白序列和生物素亲和蛋白单体序列融合而成，且所述抗体Fc亲和蛋白序列为：
[0014]MTFKLIINGKTLKGEITIEAVDAAEAEKIDKQYANDYGIDGEWTYDDATKTFTVTE。
[0015]所述生物素亲和蛋白单体序列选自单体avidin序列，序列为：
[0016]EFGPAIWQGQDTFQYVPTTEGSFDASNFKDFSSIASASSSWQNQHGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAEGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIDFSVKWNNSTENCNSNTQWTGYAQVNGNNTEIVTRWNLKYE。
[0017]优选地，所述还包括融合蛋白连接子序列。所述融合蛋白由抗体Fc亲和蛋白序列、单体avidin序列、linker以及His
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tag纯化标签序列组成，序列如下SEQ ID NO：1所示。
[0018]本专利技术还可以提供一种抗体融合蛋白标记复合物，采用上述融合蛋白与抗体和与生物素标记分子反应制备而成。
[0019]本专利技术还可以提供一种检测靶抗原的试剂盒，包含上述融合蛋白或者上述抗体融合蛋白标记复合物。
[0020]本专利技术还可以提供一种抗体定点偶联的方法，采用上述融合蛋白与抗体和与生物素标记分子反应。优选地，融合蛋白、抗体、与生物素标记分子反应的摩尔比为1.5:1:2。
[0021]本专利技术还可以提供一种编码上述融合蛋白的基因，以及包含上述基因的表达载体。
[0022]本专利技术还提供上述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：合成编码上述融合蛋白的基因，并克隆到载体中；转化大肠杆菌，诱导表达，收集菌体；将菌体进行破碎，离心，收集包涵体沉淀；将包涵体沉淀转入变性溶液中处理，再复性处理，得复性蛋白溶液；将复性蛋白溶液过Ni柱、离子交换柱除杂，获得融合蛋白粗品；将融合蛋白粗品透析至含稳定剂的PBS缓冲液中，冻存，即得。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0024]与现有依靠点击化学方案的抗体定点偶联方案相比，本专利技术的融合蛋白主要由改造的抗体Fc亲和蛋白序列、生物素亲和蛋白单体序列融合而成。本专利技术依靠改造抗体Fc的高亲和力、单体avidin与biotin标记分子的高亲和力可以实现定点偶联，使得融合蛋白的亲和力达到nM级别或以上。同时，本专利技术融合蛋白可以高效、稳定表达，客户端运输储存及使用快捷方便，且性价比高。
[0025]尤其是，pfGA(protein fusion of protein G and monomeric Avidin)融合蛋白可以满足大部分货架抗体产品的偶联，操作非常方便。客户只需要准备或购买货架抗体、pfGA蛋白、生物标记分子等，按序添加实现抗体与分子定向偶联获得抗体
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pfGA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可用于抗体定点偶联的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白主要由抗体Fc亲和蛋白序列和生物素亲和蛋白单体序列融合而成，且所述抗体Fc亲和蛋白序列为：MTFKLIINGKTLKGEITIEAVDAAEAEKIDKQYANDYGID GEWTYDDATKTFTVTE。2.根据权利要求1所述的可用于抗体定点偶联的融合蛋白，其特征在于，所述生物素亲和蛋白单体序列选自单体avidin序列。3.根据权利要求1或2所述的可用于抗体定点偶联的融合蛋白，其特征在于，所述还包括融合蛋白连接子序列。4.根据权利要求3述的可用于抗体定点偶联的融合蛋白，其特征在于，述融合蛋白由抗体Fc亲和蛋白序列、单体avidin序列、linker以及His
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【专利技术属性】
技术研发人员：冯延叶，柴智，王嘉渊，徐福桥，吴海，赖煦卉，
申请(专利权)人：上海英基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：