一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂PANCID及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂PANCID及其应用，属于细胞调控技术领域。为了提供一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂，用于光调控胞内蛋白功能。本发明专利技术提供的诱导剂是由一个纳米抗体和一个光笼保护的小分子配体偶联及与胞内递送模组连接而成的。在诱导剂进入细胞之后，在光照下光笼保护基被脱除，释放出有活性的纳米抗体—小分子配体偶联物，进而诱导胞内二聚化而实现光调控胞内进程。程。程。

【技术实现步骤摘要】
一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂PANCID及其应用


[0001]本专利技术属于细胞调控
，具体涉及一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂PANCID及其应用。

技术介绍

[0002]光调控细胞进程具有无与伦比的时间分辨率和空间分辨率，尤其适合调控和解析快速动态的胞内进程以及实现亚细胞分辨率的胞内进程的调控。目前与之最相近的技术是化学光遗传技术(chemo
‑
optogenetics，COG)包括光激活的化学诱导二聚化技术(photoactivatable chemically induced dimerization，PA
‑
CID)等。化学诱导二聚化如图1中的A所示，是通过一个容易穿膜的化学小分子在胞内引起两个蛋白的二聚化进而调控诸多胞内进程的；而光激活的化学诱导二聚化技术如图1中的B所示是通过对化学小分子进行结构修饰，使之接上一个光笼保护基团，光笼保护基团使得这个二聚化小分子暂时不能诱导蛋白质的二聚，而在光照之后，光笼保护基在光照下被脱除，释放出具有活性的二聚化CID分子进而诱导胞内蛋白的二聚从而实现对胞内进程的光调控。化学光遗传的概念更广一些，但是本质上也是基于光响应的化学小分子结合对细胞的遗传修饰而实现对细胞进程的光调控，化学光遗传技术可以认为是化学版本的光遗传(optogenetics)技术。光激活的化学诱导二聚化方法是化学光遗传技术的重要组成部分。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是为了提供一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂，用于光调控荧光蛋白嵌合体的胞内功能。所谓偶联物(conjugates)，一般指生物大分子与化学小分子相连接的产物，例如在本专利技术中就是指生物分子纳米抗体(>10kD)与小分子配体相连接的产物。
[0004]本专利技术提供一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂(photoactivatable nanobody
‑
conjugate inducers of dimerization，PANCID)，所述诱导剂PANCID是由以下部件组成：胞内递送模组、连接子、纳米抗体、小分子配体和光笼结构。其中光笼保护的小分子配体与纳米抗体偶联之后能够具有诱导胞内蛋白二聚的作用，即诱导纳米抗体所结合的靶标蛋白与小分子配体所结合的蛋白标签的二聚化，这个二聚化过程可以被用于调控诸多胞内进程和细胞活性；而胞内递送模组和连接子的作用是使纳米抗体偶联物能够良好地穿膜进入细胞内，进而能够实现对细胞内(胞内)进程的调控；光笼的作用使让小分子配体暂时不能结合相应的蛋白标签，而只有等光笼脱除，小分子配体复原，进而能够诱导胞内二聚化。诱导胞内二聚化是一种通用型的调控细胞进程和蛋白功能的策略，例如前面所提到的CID技术，以及光遗传二聚化工具等等。
[0005]进一步地限定，所述胞内递送模组、连接子、纳米抗体、小分子配体和光笼结构的连接方式为：光笼引入小分子配体上而得到光笼保护的小分子配体，之后再与纳米抗体连接获得偶联物，最后胞内递送模组通过连接子与偶联物连接。
[0006]进一步地限定，所述纳米抗体为荧光蛋白纳米抗体或者结合细胞内蛋白靶标的纳米抗体。
[0007]进一步地限定，所述小分子配体为蛋白标签结合配体。
[0008]进一步地限定，所述小分子配体为TMP。
[0009]进一步地限定，所述光笼结构为Nvoc基团。
[0010]进一步地限定，所述胞内递送模组为环状跨膜肽。
[0011]进一步地限定，所述连接子为肽键、硫醚键、二硫键、酰胺键或PEG链。
[0012]本专利技术提供一种上述的诱导剂PANCID的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
[0013]步骤S1：合成含有能与蛋白连接的光笼保护的小分子配体；
[0014]步骤S2：将步骤S1获得的光笼保护的配体与纳米抗体连接获得偶联了光笼保护的配体的纳米抗体偶联物；
[0015]步骤S3：将胞内递送模组与步骤S2获得的纳米抗体偶联物相连接，获得光控诱导剂PANCID。
[0016]本专利技术提供上述的诱导剂PANCID在光调控细胞进程中的应用。
[0017]有益效果：在本专利技术中，引入了光激活的小分子—纳抗偶联物诱导的二聚化(PANCID)技术。PANCID诱导剂包含一个纳米抗体和一个光笼保护的小分子配体偶联而成的基本骨架。由于纳米抗体偶联物本身一般无法进细胞，不能诱导胞内的二聚化过程，所以这个偶联物还携带一个环状跨膜肽的递送模组。环状跨膜肽能够让偶联物高效穿过细胞膜，规避溶酶体途径。环状跨膜肽已经被证明能够高效地将生物大分子如纳米抗体递送进细胞。如图3所示，环状跨膜肽跟纳抗偶联物可以通过二硫键相连，在PANCID诱导剂顺利进入细胞之后，在胞内还原性环境下，二硫键很容易被还原断裂，释放走环状跨膜肽。最后在光照下光笼保护基被脱除，释放出有活性的纳米抗体—小分子配体偶联物，进而诱导胞内二聚化而实现光调控胞内进程。
[0018]这个PANCID技术相比于光激活的CID技术有多个优点。首先它可以直接对广泛使用的荧光蛋白所融合的蛋白进行调控，不需要引入额外的结合标签，因而PANCID技术本身就具有通用性。引入额外的融合标签不仅更为费时费力，而且额外的融合标签可能也会对待调控蛋白产生不良影响，例如可能由于由位阻效应使待调控的蛋白的功能失活。目前荧光蛋白已经被广泛应用于生物学和生物医学等研究中，作为一种荧光标签不可或缺，所以很多融合了荧光蛋白的质粒、细胞系等等都能够直接获取，甚至基因编辑的稳转细胞系乃至模式动物都是现成的。因而PANCID手段可以对融合了荧光蛋白的靶标蛋白直接调控，是该技术的一个显著特点。此外，PANCID这种方式还可以实现对内源蛋白的直接光调控，而这个对于光激活的CID技术而言是难以直接实现的，这是因为光激活的CID技术需要遗传修饰而让蛋白接上一个亲和标签，所以不可以直接光调控内源蛋白的功能。
[0019]光遗传学也是一个光调控细胞进程的技术。显而易见，光遗传学也不可以直接调控荧光蛋白的功能，而是需要额外引入一个光响应的植物光受体或者其它的光敏蛋白。此外，光遗传学技术尽管被广泛使用，其本身也有诸多缺点的。例如其所诱导的二聚化的动态范围偏窄，其光调控的光谱与不少荧光蛋白的吸收光谱重叠，进而限制了多色成像。另外，大部分光遗传二聚化工具本质上还是调控ON和OFF两种状态间的一种平衡，换句话说是一
种上调和下调的过程，还不是真正的激活和去激活的过程，因此不管是光激活还是光去激活都会有不少的背景活性。而PANCID技术基本上可以规避所有这些缺点。由于PANCID技术基于抗体和抗原之间的相互做作用，这种互作具有很高的特异性和亲和力，因此能够实现最彻底的光调控，以及极少的脱靶效应。
附图说明
[0020]图1：化学诱导的二聚化和光激活的化学诱导的二聚化的原理示意图；其中，A是化学诱导的二聚化，B是光激活的化学诱导的二聚化。
[0021]图2：PANCID光激活二聚化诱导剂的结构示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂PANCID，其特征在于，所述诱导剂PANCID的是由以下成分组成：胞内递送模组、连接子、纳米抗体、光笼保护的小分子配体。2.根据权利要求1所述的诱导剂PANCID，其特征在于，所述胞内递送模组、连接子、纳米抗体、光笼保护的小分子配体的连接方式是：光笼保护的小分子配体跟纳米抗体连接获得纳米抗体偶联物，然后将胞内递送模组通过连接子与纳米抗体偶联物相连。3.根据权利要求1所述的诱导剂PANCID，其特征在于，所述纳米抗体为荧光蛋白纳米抗体或者结合细胞内蛋白靶标的纳米抗体。4.根据权利要求1所述的诱导剂PANCID，其特征在于，所述小分子配体为蛋白标签结合配体。5.根据权利要求4所述的诱导剂PANCID，其特征在于，所述小分子配体为TMP。6.根据权利要求1所述的诱导剂PANCID...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈西，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：