用于记录样本中单个粒子的轨迹的方法和显微镜技术

本发明专利技术涉及一种记录样本中单个粒子的运动轨迹的方法和执行该方法的光学显微镜。从至少近似已知的起始位置开始，用扫描光的具有局部强度最小值的强度分布来扫描粒子。当用扫描光照射时，待跟踪的粒子产生可探测的光信号，根据光信号的强度计算出粒子的更新坐标。根据本发明专利技术，当并行探测的第二测量变量满足中止标准时，终止扫描。终止扫描。终止扫描。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于记录样本中单个粒子的轨迹的方法和显微镜
[0001]专利技术的

[0002]本专利技术涉及根据MINFLUX原理对样本中单个粒子进行时间上跟踪的方法。本专利技术还涉及执行该方法的光学显微镜。
现有技术
[0003]对样本中单个粒子的观测和跟踪(英文：Single Particle Tracking,SPT—单粒子追踪)是研究生物系统中分子动力学的一项重要技术。为此，可以使用光散射粒子，例如金属纳米粒子；然而，通常使用荧光粒子或荧光染料的单个分子。有了荧光染料，还可以标记原本无法探测到的粒子，从而使其可用于粒子跟踪。生物应用领域包括酶催化反应、DNA转录、离子通道的活性和囊泡转运的研究。
[0004]在此，所用方法的适用性在很大程度上取决于可实现的观测时段和观测单个粒子时的时间分辨率。为此，一方面是基于显微镜的成像方法，另一方面是基于点探测器的方法，这些在现有技术中都是已知的。前者允许在更大的图像范围内观测单个粒子，从而可以在相对较长的时段内跟踪自由扩散的粒子。然而，可实现的时间分辨率受到相机帧速率的限制，这就是为什么用这种方法不可能研究快速过程。
[0005]相反，用基于点探测器的方法，特别是在使用时间分辨的单光子计数时，可以实现小到皮秒范围的高时间分辨，然而在许多应用中，观测时段仅限于单个粒子在照射光焦点中的停留时间。如果粒子可以自由扩散，则观测时段就特别短。为了克服这种限制，待跟踪的粒子、特别是单分子，往往被固定住，即绑定在固定的载体上或借助于光学镊子保持在一个地方。然而，为了使用光学镊子，单个生物分子必须与(较大的)载体粒子耦合，这严重限制了在天然生命系统中的应用。
[0006]可替代地，借助于可调节的样本保持器和闭环调节主动将分子保持在焦点中这种方式，可以延长使用单点探测器对单个粒子的观测时段。N.P.Wells等人在Nano Lett.10,4732(2010)发表的“Time Resolved 3DMolecular Tracking in Live Cells”中首次实现了对单个荧光分子的跟踪，其中在92％的甘油(即非常粘稠的介质)中的Cy5
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dUTP分子可以被实时跟踪约100ms。由于染料分子在粘度较小的介质中的扩散速度明显较高，使得单个染料分子不能再被足够快速地跟踪，并且快速地离开用于样本跟踪的调节装置的捕获范围，因此在该文章中使用的基于压电的调节器无法在粘度较小的(并因此与实践更相关的)介质中应用该方法。轨迹的最大时间长度也很短，约为100ms，这特别是由于光子预算有限，即染料分子在最终被漂白之前发出的荧光光子数量有限。
[0007]为了更快地跟踪单个粒子，特别是单个染料分子，现在有了快速光束偏转装置，特别是电光偏转器或声光偏转器，它们的定位时间达到了(亚)微秒范围，但定位范围仅限于几微米。为了能够在样本的更大范围内扫描单个粒子，这些快速非机械的扫描装置可以与振镜结合，振镜允许在样本的更大范围内对聚焦激发光进行(较慢的)预定位。
[0008]文献DE 10 2011 055 367 A1描述了一种以缩写MINFLUX著称的单粒子跟踪的变型，其中，用扫描光的具有强度最小值的光分布来照射粒子，并记录由粒子发射的光子。通
过使强度分布相对于样本偏移，使粒子发射的光子速率保持最小，从而追踪到在样本中移动的粒子的最小值。随着定位置信度的增加，强度最小值的位置可以越来越靠近被跟踪的粒子周围，并且增加了扫描光的功率，由此实现了进一步精确的定位。
[0009]MINFLUX方法的特殊优点在于其特殊的光子效率，其允许精确定位单个粒子到个位数纳米范围，即使光子数量相对较少。由于扫描是以光分布的强度最小值(理想情况下是零强度)进行的，并且强度最小值仅定位在粒子周围的附近区域内，因此只向粒子施加以低光强度。定量分析【参见K.Gwosch等人在Nat.Methods 17,217(2020)中发表的“MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells”】表明，MINFLUX方法中的定位精度的标准偏差σ遵循σ
∝
1/N
k/2
的关系，其中N是探测到的光子的数量，k是迭代步骤的数量。因此，在四次迭代后，σ
∝
1/N2，即定位的不确定性随光子数量的平方而减小。与此相反，当根据粒子的宽视场图像(例如，在STORM/PALM显微术中或通过用高斯光聚焦扫描)确定单个粒子的位置时，标准偏差仅随探测到的光子数量N的平方根而减小由于这种特殊的光子效率，即使是单个荧光染料分子(它们在不可逆漂白之前只发射非常有限数量的荧光光子)，也可以用MINFLUX方法进行比用其他方法更多的位置确定。
[0010]特别是当使用快速扫描装置时，可以在非常短的间隔内重复确定单个粒子的位置，目前可用的现有技术为约每100μs一次。由于光子效率高并且定位速度快，因此，MINFLUX方法特别适用于样本中单个荧光染料分子的实时跟踪。在此，在低粘度介质中也可以跟踪单个染料分子。从现有技术中已知，根据MINFLUX方法记录的单个染料分子的轨迹有超过25000次单位置确定。
[0011]在DE 10 2017 104 736 B3中描述了一种MINFLUX方法的变型，其中孤立存在的荧光染料分子的扫描不是通过用激发光的具有局部强度最小值的强度分布的照射来进行的，而是用激发光和荧光阻抑光的两个基本上互补的强度分布的照射来进行的。在此，激发光的强度分布具有局部强度最大值，而荧光阻抑光的强度分布在同一位置具有局部强度最小值。具体来说，荧光阻抑光可以是STED光，其通过触发受激发射来防止被激发的荧光染料分子在激发光的强度分布的边缘区域中发出荧光光子。同样，在MINFLUX方法的该实施方式中，染料分子发射的荧光强度取决于与荧光阻抑光的局部强度最小值的距离，但这里的荧光不是随着到强度最小值的距离的增加而增加，而是减小。M.Weber等人在bioRxiv，doi：10.1101/2020.10.31.363424(2020)发表的“MINSTED fluorescence localization and nanoscopy”中提出了这一概念的实验性实现。
[0012]虽然具有许多位置确定的单个粒子的长轨迹原则上是可取的，但问题是轨迹在其整个长度上是否包含对给定问题有意义的信息。例如，如果粒子与结合位点之间的距离过大，则对样本中被跟踪的粒子与结合位点之间可能的相互作用的研究就不能提供相关信息。此外，如果在记录轨迹期间细胞进入非代表性状态(例如，由于细胞分裂或凋亡)，则从轨迹中推导得到的信息可能是不相关的，甚至是误导性的。此外，过度的扫描还会导致可避免地向样本施加以扫描光，并导致不必要的长的测量持续时间。
[0013]专利技术任务
[0014]因此，本专利技术的任务在于展示用于跟踪样本中单个粒子的运动的方法和光学显微镜，其中，当对粒子的跟踪不再提供与给定问题相关的信息时，对粒子的跟踪本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于记录样本(19)中单个粒子(2)的轨迹(10)的方法，所述方法从所述粒子(2)的至少近似已知的起始位置(3)开始，包括以下重复执行的方法步骤：在一个或更多个扫描位置(4)处用扫描光(5)的具有局部最小值(8)的强度分布(7)来扫描所述粒子(2)；探测由于在所述扫描位置(4)中的每个扫描位置处用所述扫描光(5)照射而由所述粒子(2)发射的光子数量或光强度作为第一测量变量；根据在所述扫描位置(4)探测到的光子数量或探测到的光强度来确定所述粒子的更新坐标，并将所述更新坐标添加到所述轨迹(10)中，其特征在于，在记录所述轨迹(10)期间，在所述样本(19)中检测第二测量变量(11)，并且当所述第二测量变量(11)或根据所述第二测量变量(11)计算的控制值(12)满足中止标准时，中断或终止对所述轨迹(10)的记录。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在多次确定所述粒子(2)的更新坐标的过程中，调整、特别是增加所述扫描光(5)的光功率。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述粒子(2)是荧光粒子或荧光染料分子。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扫描光(5)是激发所述粒子发出荧光的荧光激发光。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扫描光(5)是荧光激发光和荧光阻抑光的叠加，其中，所述荧光阻抑光包括具有局部强度最小值(8)的强度分布(7)。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，针对所述粒子(2)的每次更新，在围绕最后确定的坐标附近的多个扫描位置(4)处扫描所述粒子。7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在扫描位置(4)处每次扫描所述粒子(2)之后，更新所述粒子(2)的坐标。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，如果所述第二测量变量(11)或所述控制值(12)低于最小值(16)或超过最大值，则满足中止标准。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，如果所述第二测量变量(11)或所述控制值(12)再次超过所述最小值(16)或者再次低于所述最大值，则继续所述扫描。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，在所述样本(19)中所述扫描光(5)的位置处探测所述第二测量变量(11)。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，在所述样本(19)中所述粒子(2)的当前坐标周围的环境中探测所述第二测量变量(11)。12.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，在所述样本(19)的固定位置处或固定范围中探测所述第二测量变量(11)。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二测量变量(11)是光学测量变量。14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第二测量变量(11)是荧光信号。15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，根据所述荧光信号和另一荧光信号、特别是根据这些信号的比值计算所述控制值(12)。
16.根据权利要求14或15所述方法，其特征在于，所述控制值(12)是根据所述荧光强度或根据一个荧光信号或多个荧光信号的荧光寿命计算的变量，特别是pH值、离子浓度、膜电位或荧光各向...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：阿贝锐纳仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：