对生物样本进行光显微镜多尺度记录的方法和设备技术

提出了对用多种染料(90)染色的样本(7)进行成像的方法(41、42、43、44、45)和设备(1)。这些方法(41、42、43、44、45)使得高达分子分辨率的纳米成像能够置于显微镜成像的空间环境中或者在显微镜成像的空间环境中能够执行单个分子的纳米跟踪。这些方法(41、42、43、44、45)以特别有效的方式组合了不同的光学显微术方法。分子分辨率可以通过定位显微镜方法实现，特别是通过根据MINFLUX方法或STED

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对生物样本进行光显微镜多尺度记录的方法和设备
[0001]专利技术的

[0002]本专利技术涉及光学显微术(lichtoptische Mikroskopie)的方法，特别是对生物样本的超分辨率、无衍射限制的光学荧光显微术的方法。本专利技术还涉及组合方法，其中无衍射限制的光学荧光显微术方法构成组成部分。此外，本专利技术还涉及具有光技术的但非荧光显微镜的工艺部件的工艺组合，以及具有非光学的工艺部件的工艺组合。此外，本专利技术涉及相应的设备。
现有技术
[0003]从德国专利文献DE 10 2018 126 232 B3中已知一种具有多个光源的扫描显微镜。光源可以是窄带激光器或白光激光器。光源借助于二向色镜分别被单独或共同地耦合到一个共同的照射光路中。耦合发生在探测光在相反方向照射透过的区段中。不同光源的集合可设置用于不同的目的，例如，集合中的各个光源可以为共焦显微镜记录、借助于MINFLUX纳米显微镜的记录或借助于STED显微术对不同染料的记录提供激发光。光源也可以用作荧光阻抑光的光源，特别是用作STED光的光源。在这种情况下，显微镜还必须具有光束整形装置，该装置调节照射光的波前，以便在物镜的焦点处形成荧光阻抑光的、由强度极大值包围的强度零点。MINFLUX纳米显微镜中也必须有相应的光束整形装置。该专利涉及一种更换设备，借助于该更换设备，当有关光源不需要用于照射时，将与光源相关联的二向色镜替换为平面平行板，该平面平行板对光路施加与二向色镜相同的平行偏移。这一方面保证了在不需要的光源的波长下从样本发射的光也可以被探测到，另一方面也保证了光路的相互对准保持不变。扫描显微镜还具有：物镜，通过该物镜将照射光聚焦到样本上；以及扫描仪，该扫描仪使照射光的光强分布相对于样本移动，并对探测光进行反扫描(entscannen)。此外，扫描显微镜在探测光路中具有由可调节的短通滤波器和可调节的长通滤波器组成的可调节的波长选择带通滤波器。通过滤波器的光通过探测光输出端被送入探测器，而反射光则被送入另一输出端。随后，该反射光可被送入另一可调节的波长选择带通滤波器，也就是说，该滤波器可以级联。在滤波器的帮助下，可以通过不断调谐滤波器来分析探测光的光谱。
[0004]从德国公开文献DE 10 2010 015 915 A1中已知一种借助于显微镜实施的测定样本中荧光染料的激发光谱和发射光谱的方法。显微镜配备有多个探测器，其中探测器交替地探测不同波段的光。所有波段都可以发生光谱位移，但即使在位移之后，探测器也会交替地探测到不同波段的光。此外，显微镜具有激光器，该激光器的发射波长可以发生光谱位移。为了测定激发光谱，用第一波长对样本进行第一激发，并用相对于光谱探测波段处于第一设置的多个探测器来测量荧光，然后进行激发波长的位移，用处于第一设置的多个探测器再次测量产生的荧光；必要时多次反复；在具体示出的实施方式中，用总共五个激发波长依次进行激发，并用五个探测器进行探测。这个序列构成激发步骤的第一运行。在该运行中，通过确定每个激发波长的单个探测器信号之和来获得激发光谱的(五个)第一支持点(St
ü
tzstelle)。同时，对于(五个)激发波长中的每一个都获得了具有多个(五个)支撑点的
发射光谱；根据公开文献，将获得可用于测定发射光谱的信息。根据激发波长和探测波段之间关系的图形表示，在第一运行中，第一探测器的探测波段刚好在第一激发波长以上开始，第二探测器的探测波段刚好在第二激发波长以上开始，以此类推。随后，相应地进行第二运行，一方面，所有探测器的探测波段被位移一定量，另一方面激发波长被位移相同的量。在此，根据图形表示，长波探测器的波段变得更窄，因为探测范围的下临界波长改变了，但上临界波长没有改变。在第二运行中，将获得激发光谱的(五个)另外的支持点。现在可以用进一步位移的激发波长和探测波段进行相应的进一步运行。这种位移正好持续直到随着进一步的位移，下一运行的第一激发波长对应于第一运行的第二激发波长。这意味着，每个单独的激发波长都正好用于探测器的光谱波段一次设置。运行可以并且最好在样本的扫描成像过程中进行。优选地，样本的扫描和样本的检测以如下方式进行，即在完全检测导光谱的情况下就可以得到样本的完整图像。在该文献中进一步指出，对于每个激发波长，从各个探测器的信号获得发射光谱，在上述实施例中是有五个支撑点。可以通过增加单个探测器的数量来增加支持点的数量。此外，还声称具有相同发射光谱的染料可以基于不同的激发光谱来区分，这使得在多种染色的样本中能够对染料单独成像。然而，仔细观察就会发现，作为唯一实施例而特别给出的方法是有缺陷的，并且关于应用于多重染色的样本的说法并不适用。这是因为探测范围的下临界波长随着激发波长从一个运行到另一运行的位移而位移，而使检测的波长范围从一个运行到另一个运行发生变化，该波长范围变得更小，因此与在第一运行中获得的值相比，在第二运行中获得的值将系统性和不按比例地变得过小。如果样本中存在多种染料，则无论上述问题如何，都根本不可能确定染料中单一染料的激发光谱。这是因为在激发过程中，总是多种染料被激发，因此探测器总是探测到总和信号。只有当单一染料的激发光谱是已知的，才有可能将总和信号分解成其各个加数。如果是这种情况，则可以确定染料在激发范围内的比例。但实际上，首先应根据方法确定激发光谱。
[0005]在现有技术中多次提及显微镜，特别是具有光谱灵敏度范围可调节的探测单元的共焦激光扫描显微镜。德国公开文献DE 10 2006 034 908 A1就是一个示例。探测波长根据各样本中存在的荧光团来定期调节。滤波器的可调性用于在开始对样本进行图像采集之前，只需对部件进行调节，而不需要进行更换。
[0006]MINFLUX纳米显微术仍是一种新的显微显微术方法。MINFLUX纳米显微术是一种定位显微显微术的方法。荧光团的定位是借助于结构化的激发光分布来进行的。MINFLUX纳米显微术的基本特征在于，荧光团被激发的方式是，待定位的荧光团始终被置于靠近或处于激发光分布的最小值，该最小值理想情况下是零点，其中激发光分布在最小值附近具有强度上升区域。由此，在获得有关各发射荧光团位置的信息方面可以更好地利用荧光光子。这也适用于跟踪荧光团随时间运动的应用。利用激发最小值观察样本是MINFLUX纳米显微术的基础，从专利DE 10 2011 055 367 B4(这里最初仅用于跟踪样本中单个分子的运动)和DE 10 2013 114 860 B3中已知。在DE 10 2011 055 367 B4中，还提到了同时跟踪两种不同荧光团的可能性。为此，将使用两种不同的光源，在这两种光源之间快速切换。
[0007]在此基础上，出现了一系列用于信息获取的改进措施使荧光团定位的不确定性能够在2nm以下的范围内。该不确定性的大小对应于荧光团的扩展范围。关于MINFLUX纳米显微术的详细介绍参见Francisco Balzarotti等人的“Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于对用多种染料染色的样本(7)进行定位显微镜检查(200)的方法，包括：对所述样本(7)或所述样本的子区域(101、102、103)的图像数据进行第一采集(100)，基于所述图像数据确定和选择感兴趣的样本区域(80)，用第一激发波长的激发光(31)激发在所选择的感兴趣的样本区域(80)内的第一子区域中的荧光团(90)，并使用第一探测单元(2)在第一波长范围内对由激发的荧光团(90)发射的荧光光子进行第一探测，用一个探测单元(2)或所述探测单元(2)在第二波长范围内对由用所述第一激发波长的激发光(31)激发的荧光团(90)发射的荧光光子进行第二探测，所述第二波长范围不同于所述第一波长范围，其特征在于，所述第一探测单元(2)被设计成，所述第一探测单元(2)探测到荧光光子的波长范围是可调节的，并且所述方法还包括：在多个光谱探测通道中对所述样本(7)进行定位显微镜图像采集时，确定用于多种染料的优化的比率法分离的波长范围，其中在所述感兴趣的样本区域(80)中，根据MINFLUX方法或STED
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MINFLUX方法执行单个荧光团(90)的定位(200)或跟踪，其中所述荧光光子的探测分别在针对多种染料的优化的比率法分离所确定的波长范围内进行。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于所述图像数据在所述感兴趣的样本区域(80)内选择所述第一子区域，使得在所述第一子区域中只包含或基本上只包含第一染料的荧光团(90)，并且在所述第一子区域中，用所述第一激发波长的激发光(31)激发多个荧光团(90)，并且从所述第一探测和所述第二探测获得表征所述第一染料的光谱发射的第一值和第二值。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，基于所述图像数据在所述感兴趣的样本区域(80)内选择第二子区域或可选的另外的子区域，使得在所述第二子区域或每个可选的另外的子区域中只包含或基本上只包含第二染料或另外的染料的荧光团(90)，并且在所述第二子区域或每个另外的子区域中用所述第一激发波长的激发光(31)激发多个荧光团(90)，并且在所述第一波长范围和所述第二波长范围内对由各激发的荧光团(90)发射的荧光光子进行探测，并且分别获得表征所述第二染料或各个所述另外的染料的光谱发射的第一值和第二值。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在一个或更多个另外的波长范围内对分别用所述第一激发波长的激发光(31)激发的所述第一染料、所述第二染料或所述另外的染料中的一种染料的荧光团(90)发射的荧光光子进行进一步的探测，从而从对用多种染料染色的样本(7)的测量中获得表征所述第一染料、所述第二染料或所述另外的染料中的一种染料的光谱发射的多个值，所述一个或更多个另外的波长范围彼此不同并且不同于所述第一波长范围和所述第二波长范围。5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，交替不同的波长范围不重叠。6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其特征在于，用于优化的比率法分离的波长范围是分别从表征所述第一染料或所述第二染料或可选的另外的染料的光谱发射的所述第一值和所述第二值中获得的，或从多个这样的值中获得的。7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一探测单元(2)用于在
不同波长范围内进行探测。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于所述图像数据选择所述感兴趣的样本区域(80)内的第一子区域，使得在所述第一子区域中包含多种染料的荧光团(90)，并且在所述第一子区域中反复激发单个荧光团(90)，其中所有多种染料的荧光团(90)被整体激发。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用所述第一激发波长的激发光(31)对荧光团(90)进行另外的激发，并在另外的两个波长范围内进行另外的探测，其中所述另外的两个波长范围中的至少一个波长范围既不是所述第一波长范围也不是所述第二波长范围。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述第一波长范围和所述第二波长范围在第一临界波长处彼此相邻。11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述另外的两个波长范围在一个临界波长处或所述临界波长处或另外的临界波长处彼此相邻。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，多次进行另外的激发和探测，其中每次都选择不同的另外的临界波长。13.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述第一波长范围和/或所述另外的波长范围中一个波长范围包括小于所述第一激发波长的波长，优选地仅包括小于所述第一激发波长的波长。14.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，其特征在于，在两个波长范围内、在所述第一波长范围和所述第二波长范围内和/或在所述另外的两个波长范围中的一个波长范围和另一个波长范围内进行探测期间，分别将探测到的荧光光子与单个荧光团(90)的突发相关联，并且分别为所述突发确定在一个波长范围和另一个波长范围内探测到的荧光光子的数量。15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，用于优化的比率法分离的所述波长范围是根据为所述突发确定的在一个波长范围和另一个波长范围内探测到的荧光光子的数量确定的。16.一种用于对用多种染料染色的样本(7)进行定位显微镜检查的方法，包括：对所述样本(7)或所述样本的子区域(101、102、103)的图像数据进行第一采集，基于所述图像数据确定和选择感兴趣的样本区域(80)，使得在所述感兴趣的样本区域(80)中包含多种染料的荧光团(90)，根据MINFLUX方法对所述多种染料的单个荧光团(90)进行定位(200)，其中用第一激发波长的激发光(31)进行激发，并且其中在第一波长范围和第二波长范围内分别对荧光光子进行探测，所述第二波长范围不同于所述第一波长范围，其特征在于，所述方法还包括：根据MINFLUX方法或STED
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MINFLUX方法对所述多种染料的单个荧光团(90)进行定位(200)，其中在另外的两个波长范围内分别对荧光光子进行探测，其中所述另外的两个波长范围中的至少一个波长范围与所述第一波长范围或所述第二波长范围不一致。17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一波长范围和所述第二波长范围在第一临界波长处彼此相邻。18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述另外的两个波长范围在另外的临界
波长处彼此相邻，所述另外的临界波长与所述第一临界波长不一致。19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一波长范围和/或所述另外的波长范围中的一个波长范围包括小于所述第一激发波长的波长，优选地仅包括小于所述第一激发波长的波长。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，对图像数据的所述第一采集(100)包括对所述样本(7)进行扫描的采集步骤，其中所述扫描是通过在所述激发光(31)的光学路径(21)中应用第一偏转单元(4)来完成的。21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述扫描包括用聚焦的激发光和荧光阻抑光、优选用STED光，进行共焦扫描或共同扫描。22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，在使用聚焦的激发光和荧光阻抑光进行共焦扫描或共同扫描时，所述探测是在连续的波长范围内进行的，并且是以非光谱分辨的方式进行的。23.一种用于对用多种染料染色的样本(7)进行定位显微镜检查方法，包括：对所述样本(7)或所述样本(7)的子区域(101、102、103)的图像数据进行第一采集(100)，基于所述图像数据确定和选择感兴趣的样本区域(80)，使得在所述感兴趣的样本区域(80)中包含多种染料的荧光团(90)，根据MINFLUX方法或STED
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MINFLUX方法对所述多种染料的单个荧光团(90)进行定位(200)，其中用第一激发波长的激发光(31)进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：G，
申请(专利权)人：阿贝锐纳仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：