【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于记录多重染色样本的纳米级图像的方法和设备
[0001]专利技术
[0002]本专利技术涉及定位显微术(Lokalisationsmikroskopie),特别是MINFLUX显微术。本专利技术能够改进对多重染色(即,用多种不同的荧光标记物染色)的样本的纳米级成像,以及跟踪多重染色样本中的各个分子(即,荧光团)。
现有技术
[0003]定位显微术允许以低于阿贝衍射极限的分辨率对样本进行成像。为了对样本进行成像,用标记物给样本染色,这些标记的行为方式是每次至少在一定的时间段内是能发出荧光的,也就是说,这些标记至少在一定的时间段内处于它们可以被激发发出荧光的状态,而在大多数时间内不能发出荧光。这通常被称为所使用的标记物闪烁。例如,这可能是由于标记物的总集合处于平衡状态,其中一小部分标记物是能发出荧光的,而一大部分标记物是不能发出荧光的。制备或处理样本的方式是,尽管平均分布在样本上的一些或甚至大量标记物都是能发出荧光的,但能发出荧光的标记物彼此之间的距离通常大致等于或大于例如衍射限制的激发光斑的直径。如果现在将激发光施加于样本,则可以以空间分辨的方式探测到各个能发出荧光的荧光团的光,以便为每个单独的荧光团获得图像,荧光团的位置可以以远小于阿贝衍射极限的不确定度来确定。可替代地,也可以将例如具有一系列结构性激发光分布的激发光施加于样本,这样就可以基于对激发的了解,根据探测到的荧光以远小于阿贝衍射极限的不确定度来确定能发出荧光的标记物的位置。现在,大量标记物的位置是按时间顺序确定的,其中,在宽视场中应用定位显微术或在并行的定位 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于研究用多种染料染色的样本的定位显微镜方法,所述方法包括:第一激发和探测(10),其中,将第一波长的激发光施加到所述样本的子区域(1),并且其中,从所述样本的子区域(1)中探测由于用所述第一波长的激发光进行激发而由染料的孤立荧光团发射的荧光(92),并获得第一探测信号(51),对所述孤立荧光团进行第一定位(11)并获得第一位置(12),第二激发和探测(20),其中,将第二波长的激发光施加到所述样本的子区域(1),并且其中,从所述样本的子区域(1)中探测由于用所述第二波长的激发光进行激发而由所述染料的孤立荧光团发射的荧光(92),并获得第二探测信号(52),对所述孤立荧光团进行第二定位(21)并获得第二位置(22),确定所述第一位置(12)和所述第二位置(22)之间的差值(61)。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样本的子区域(1)是具有小于3μm、优选小于2μm的范围的小视场区域(42),并且所述第一波长的激发光和所述第二波长的激发光是具有焦点和强度分布的聚焦光(3)。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述第一波长的聚焦光(3)的强度分布具有中心最小值(4),特别地基本上是圆环分布或局域空心光束分布,并且通过将所述第一波长的激发光的焦点定位在所述子区域(1)内的位置处来进行所述第一激发,进一步地,特征在于,所述探测包括探测由于用所述第一波长的激发光进行激发而由所述孤立荧光团发射的荧光(92),用具有空间分辨率的探测器在与所述焦点所在平面共轭的平面中探测所述荧光(92),或者在垂直于光轴取向的平面内将探测孔径定位在所述光轴周围的多个位置处。4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述第一波长的聚焦光(3)的强度分布具有中心最大值(4),特别地基本上是高斯分布,并且通过将所述第一波长的激发光的焦点定位在所述子区域(1)内的一系列位置处来进行所述第一激发和探测(10),其中将所述第一波长的激发光施加到所述样本的子区域(1)。5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法,其特征在于,所述第二波长的聚焦光(3)的强度分布具有中心最小值(5),特别地基本上是圆环分布或局域空心光束分布,并且通过将所述第二波长的激发光的焦点定位在所述子区域(1)内的、包围所述第一位置(12)的一系列标称位置处来进行所述第二激发,其中所包围的区域具有第一范围。6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法包括:为了对所述样本的子区域(1)进行进一步激发,基于所述第一探测信号(51)和/或所述第二探测信号(52),从至少两个波长的预定集合(117)中选择(33)波长,使得获得选择的波长;以及在所述选择(33)之后进行进一步激发和探测(15),其中,将所选择的波长的激发光施加到所述样本的子区域(1),并且其中,从所述样本的子区域(1)中探测由于用所述选择的波长的激发光进行激发而由所述染料的孤立荧光团发射的荧光(92),并获得进一步探测信号,连同获得所述进一步探测信号(115),对所述孤立荧光团进行进一步定位(113)并获得进一步位置(114)。7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,选择(33)所述波长是通过针对染料评估(32)所述第一探测信号(51)和/或所述第二探测信号(52)进行的,该染料的孤立荧光团已
发射被探测到的荧光(92)。8.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于,所述选择的波长是所述第一波长或所述第二波长。9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法,其特征在于,所述选择的波长的激发光是具有焦点和强度分布的聚焦光(3),所述强度分布具有中心最小值(5),特别地基本上是圆环分布或局域空心光束分布,并且通过将所述选择的波长的激发光的焦点定位在所述子区域内的一系列标称位置处来进行所述进一步激发和探测(110),所述一系列标称位置包围根据所述第一位置(12)和/或所述第二位置(22)计算的中心位置,其中,所包围的区域具有小于所述第一范围的第二范围,定位在所述子区域内,其中,如果所述选择的波长是所述第一波长,则所述中心位置是所述第一位置,如果所述选择的波长是所述第二波长,则所述中心位置是所述第二位置,如果所述选择的波长是介于所述第一波长与所述第二波长之间的另外的波长,则通过从所述第一位置和所述第二位置进行内插来确定所述中心位置;以及如果所述选择的波长是大于所述第一波长和所述第二波长或小于所述第一波长和所述第二波长的另外的波长,则通过从所述第一位置(12)和所述第二位置(22)进行外插来确定所述中心位置。10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法,其特征在于,在预定的时间跨度(40)之后或当所述第一探测信号(51)的光量值(50)达到阈值时,所述第一激发和探测(10)终止。11.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述选择的波长是所述第一波长,并且连续地或迭代地对所述孤立荧光团执行所述进一步激发和探测(15)和所述进一步定位,直到获得具有最高为预定不确定度的进一步位置,其中在这种情况下,所述进一步位置是所述第一位置(12),并且只有在所述进一步激发和探测(15)终止之后才执行所述第二激发和探测(20)和所述第二定位(21)。12.一种用于研究用多种染料染色的样本的定位显微镜方法,其特征在于,针对所述样本的子区域(1)的集合,执行根据权利要求2至11中任一项所述的方法,其中,以这种方式获得的子区域(1)的集合既包括由第一染料的相应的孤立荧光团发射荧光(92)并探测到荧光(92)所在的子区域(1),也包括由另一染料的相应的孤立荧光团发射荧光(92)并探测到荧光(92)所在的子区域。13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,根据用不同波长的激发光获得的各个孤立荧光团的位置(12、22、56、57、114)和这些位置的差值(61),确定用于将所有位置在共同的空间参考系中共配准的带有校正矢量的地图。14.根据权利要求13所述的方法,其特征在于,对于所述位置(12、22、56、57、114)中的每个位置,存储关于进行所述激发和探测(10、15、20、110)以进行定位发生的时间的信息,并且所述带有校正矢量的地图是依赖于时间坐标的地图。15.根据权利要求13或14所述的方法,其特征在于,根据所述第一位置(12)和所述第二位置(22)、和/或所述第一位置和所述进一步位置、和/或所述第二位置和所述进一步位置,以及可选地根据通过用所述第一波长的激发光或所述第二波长的激发光或所述另外的波长之一的激发光进行激发和探测来获得的其他位置,生成所述样本的图像。
16.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样本的子区域(1)是宽视场区域,并且所述探测是将所述子区域(1)成像到宽视场探测器上,其中,在所述宽视场探测器上以具有空间分辨率的方式探测由所述孤立荧光团发射的荧光,从而获得具有空间分辨率的探测信号,其中,在进行所述第一激发和探测(10)和所述第二激发和探测(20)时,从所述样本的子区域(1)中探测由于用相应波长的激发光进行激发而由多个孤立荧光团整体发射的荧光,并且针对多个孤立荧光团分别获得具有空间分辨率的第一探测信号和第二探测信号(51、52)。17.根据权利要求16所述的方法,其特征在于,所述方法包括:基于相应的具有空间分辨率的第一探测信号和第二探测信号(51、52)对多个孤立荧光团进行第一定位和第二...
【专利技术属性】
技术研发人员:B,
申请(专利权)人:阿贝锐纳仪器有限公司,
类型:发明
国别省市:
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