通过自适应扫描定位单个荧光染料分子的方法和荧光显微镜技术

描述了一种通过用扫描光(26)的具有局部最小值的强度分布来对荧光染料(9、11)的单个染料分子(4、5、6)进行空间上高精度定位的方法，该方法的特征在于，扫描不是对所有染料分子(4、5、6)统一进行的，而是单独适应于待扫描的各染料分子(4、5、6)，如有必要的话还适应于该染料分子在样本(27)中的环境，以便以尽可能少数量的荧光光子实现尽可能精确的定位。在此，在扫描染料分子(4、5、6)之前，借助于扫描式激光显微镜来采集样本(27)的网格图像(1)或样本(27)的包括染料分子(4、5、6)的片段的网格图像(1)，并根据染料分子(4、5、6)位置处的网格图像(1)的一个像点的信号或根据染料分子(4、5、6)周围环境的网格图像(1)的多个像点的信号来确定用于扫描染料分子(4、5、6)的扫描规则。6)的扫描规则。6)的扫描规则。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过自适应扫描定位单个荧光染料分子的方法和荧光显微镜
[0001]专利技术的

[0002]本专利技术涉及根据MINFLUX原理的高分辨率的定位显微镜。特别地，本专利技术涉及在多个扫描位置扫描荧光染料的单个染料分子时单独调整扫描参数以确定染料分子的位置的方法。本专利技术还涉及执行该方法的荧光显微镜。
现有技术
[0003]文献WO 2015/097000 A1描述了一种用于定位空间上孤立的荧光染料分子的方法，该方法现在以首字母缩写MINFLUX而闻名，其中在不同的位置以激发光的具有强度最小值的强度分布扫描每个单独的染料分子。针对每个扫描位置，记录被激发光激发的荧光发射，并且根据荧光的强度沿强度最小值位置的走向推断出各个分子的位置。当然，这种定位是有误差的，但通过迭代地应用该方法可以降低定位的误差。为此，在每个迭代步骤之前都对扫描位置进行调整，即将扫描位置布置得更靠近分子的各自假定的位置。同时，增强激发光的强度，使得强度梯度在强度最小值附近增大。可替代地，可以增加测量持续时间，这相当于在有效光量方面增加激发光的强度。利用调整的参数，在每个经调整的扫描位置依次照射分子，并记录荧光发射的强度。根据荧光信号与强度最小值的位置的相关性，现在可以用比之前更小的误差来确定分子的位置。这些方法步骤可以重复进行，直到定位收敛或者直到达到另一中止标准，例如预先设定的最大可接受误差。根据现有技术，MINFLUX方法可实现的定位精度约为1nm，代表了最精确的商业化荧光分子定位方法。
[0004]文献WO 2015/097000 A1进一步公开了可以从各个分子的位置数据中获得样本中分子分布的(高分辨率)图像(“MINFLUX成像”)。该方法对应于STORM和PALM显微镜中通常已知的从单个荧光分子的多个定位生成高分辨率图像的方法，但在MINFLUX显微镜的情况下，图像的空间分辨率进一步提高到5nm。
[0005]在DE 10 2017 104 736 B3中，描述了一种MINFLUX方法的变型，其中分离的荧光染料分子的扫描不是通过用激发光的具有局部强度最小值的强度分布进行照射的，而是用激发光和荧光阻抑光的两个基本上互补的强度分布进行照射。在此，激发光的强度分布具有局部强度最大值，而荧光阻抑光的强度分布在同一位置具有局部强度最小值。具体地，荧光阻抑光可以是STED光，该STED光防止在激发光强度分布的边缘区域中被激发的荧光染料分子由于受激发射的触发而发射荧光光子。因此，在该方法的本实施方式中，激发光和荧光阻抑光与和RESOLFT和STED显微镜相同的强度分布叠加在一起。在MINFLUX方法的这种变型中，利用了这样一个事实，即针对各个荧光染料分子记录的荧光强度取决于荧光染料分子与荧光阻抑光的局部强度最小值的间距，并且荧光染料分子的位置可以根据针对荧光阻抑光的强度最小值的多个位置记录的荧光强度以高精度来确定。同样，在MINFLUX方法的这种变型中，局部强度最小值可以被定位在样本中的几个位置处，记录的荧光强度可以根据与MINFLUX显微镜相同的原理进行评估。但区别在于，在MINFLUX显微镜中，荧光标记物的荧光强度随着荧光标记物的位置与局部强度最小值位置的间距的增加而增加，而在该方法的实施方式中(其中，另外的光是荧光阻抑光)，荧光强度则随着间距的增加而减小。
[0006]为了根据所描述的MINFLUX方法之一来记录高分辨率图像，需要扫描多个染料分子并确定这些染料分子的位置。与定位显微镜(例如，STORM或PALM显微镜)的其他方法相比(在这些方法中将许多染料分子同时成像到相机上并确定它们的位置，因此这些方法是固有平行化的)，根据MINFLUX方法的图像采集相对缓慢，因为(至少在目前已知的实施方式中)必须根据上述程序对每个发光染料分子依次进行定位。因此，样本在相对较长的时间内受到光的辐射，这可能导致荧光染料的褪色，或者在活体样本中由于光毒性作用而有可能对样本造成损害。
[0007]为了最小化MINFLUX方法的这些弱点，根据优化的方案扫描染料分子是可取的，以便能够在尽可能短的时间内以尽可能高的光子效率定位。特别地，应避免不必要的扫描。J.Pape等人在“Multicolor 3D MINFLUX nanoscopy of mitochondrial MICOS proteins”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 117(34)，20607(2020)中使用了与此相关的方法，其方式是：将染料分子的扫描限制在用相机获得的样本的荧光图像中识别的区域。这种方法避免了扫描那些可归因于样本中非特异性的和不需要的背景染色的染料分子。
[0008]已知单个染料分子的荧光发射是以所谓的突发(Burst)方式进行的，即由短暂停顿中断的时间有限的荧光光子齐射(Salven)。在此，突发期间的平均荧光发射率、突发的持续时间、突发中发射的荧光光子总数以及中断的频率和持续时间因染料而异，但也取决于染料分子的结合状态或染料分子周围的介质(例如，缓冲液)的组成。激发光的强度也会极大地影响突发特性。即使是结构上相关且具有相似的光谱吸收和荧光特性的荧光染料(如市售的青色染料647和647)，在其突发的表现上也会有很大的不同，此外还与介质的组成有很大的依赖性。
[0009]根据MINFLUX原理对单个染料分子进行定位的精确性在很大程度上取决于染料分子在漂白或恢复到非荧光状态前所发出的荧光光子的总数。最终，这个数字对可实现的定位精度设定了极限。然而，不仅荧光光子的总数对定位精度有决定性作用，而且荧光光子在不同扫描位置的分布也是如此。考虑到所有荧光光子仅在单个扫描位置发射并被探测到的极限情况，可以立即看出，定位需要荧光光子在多个扫描位置上的(均匀)分布。因此，荧光分子的扫描，特别是扫描位置的数量和在每个扫描位置的停留时间，必须与荧光光子的(平均)总数(如突发的平均持续时间)相适应。按照统一的方案扫描所有染料分子，而不管染料分子的类型和周围环境如何，在任何情况下都是不利的。
[0010]专利技术任务
[0011]本专利技术的任务在于给出以下方法，该方法根据MINFLUX原理实现了光子高效和速度优化的数据记录。该方法的目的一方面是单独调整单个染料分子的扫描，以便用尽可能少的荧光光子进行尽可能精确的定位。另一方面，该方法通过以下方式缩短了数据记录的时间：使用与相应染料匹配的扫描参数进行扫描，并且避免了不必要的扫描步骤。同时，使用该方法可以减少样本的照射，从而减少扫描位置处的荧光染料的漂白，也可以减少样本的邻近区域中荧光染料的漂白。最后，光剂量的减少也降低了由于光毒性作用而在样本中发生损害的风险。
[0012]解决方案
[0013]本专利技术的任务通过根据独立权利要求1的方法和根据独立权利要求26的荧光显微镜来解决的。从属权利要求2至25涉及该方法的优选实施例，而从属权利要求27至30涉及荧
光显微镜的优选实施例。
[0014]专利技术描述
[0015]本专利技术基于以下认识：为了根据MINFLUX原理实现光子高效的和速度优化的数据记录，染料分子的扫描本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对样本(27)中的一种或更多种荧光染料(9、11)的单个染料分子(4、5、6)进行空间上高精度定位的方法，其中，所述荧光染料(9、11)能够在第一荧光状态(12)和第二状态之间在至少一个方向上转变，所述第一荧光状态在荧光波长范围内能够被激发变成荧光发射，所述第二状态在所述第一状态激发时在所述第一状态的荧光波长范围内不表现出荧光发射，所述方法包括以下方法步骤：生成处于第一荧光状态(12)的单个染料分子(4、5、6)的分布，其中在用激发光(25)激发时发射相同荧光波长范围内的荧光的相邻荧光染料分子(4、5、6)的间距高于光学衍射极限值；从所述分布中选择荧光染料分子(4、5、6)，其中所选择的染料分子(4、5、6)的位置是近似已知的，优选地其位置不确定性小于250nm；用所述激发光(25)激发所选择的染料分子(4、5、6)；按照扫描规则在距所述染料分子(4、5、6)的位置不超过250nm的距离布置的多个扫描位置(16、21)用扫描光(26)的具有局部最小值的强度分布来扫描所述染料分子(4、5、6)，其中所述扫描光能够是所述激发光(25)或荧光阻抑光；在每个扫描位置(21)探测荧光(34)的光子数量或强度；根据所述荧光(34)的光子数量或强度以及所述扫描位置(16、21)来确定所述染料分子(4、5、6)的位置，其中位置不确定性至少减少了10倍，其特征在于，在扫描所述染料分子(4、5、6)之前，借助于扫描式激光显微镜记录所述样本(27)的网格图像(1)或所述样本(27)的包括所述染料分子(4、5、6)的片段，并且根据所述染料分子(4、5、6)的位置处的所述网格图像(1)的一个像点的信号或根据所述染料分子(4、5、6)周围环境的所述网格图像(1)的多个像点的信号来确定用于扫描所述染料分子(4、5、6)的扫描规则。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扫描规则(17、20)设定了以下参数中的一个或更多个：所述样本中所述扫描位置(16、21)的数量和部位，与所述扫描位置(16、21)相关联的扫描持续时间，与所述扫描位置(16、21)相关联的所述荧光(34)的最小光子数量或最小强度，在所述扫描位置(16、21)之间插入的等待时间，与所述扫描位置(16、21)相关联的所述激发光和/或所述扫描光的强度，所述激发光和/或所述扫描光的波长。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，确定所述扫描规则(17、20)包括从预先设定的扫描规则(17、20)集合中选择一扫描规则(17、20)。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述集合中的扫描规则(17、20)适应于不同荧光染料(9、11)的特性。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，选择所述扫描规则(17、20)是通过针对该任务训练的人工神经网络来执行的，所述人工神经网络使用所述网格图像(1)或从所述网格图像(1)计算的输入向量作为输入。6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，确定所述扫描规则(17、20)包括计算函
数或执行算法，其中将所述网格图像(1)的一个或更多个像点的所述信号作为自变量传递给所述函数或所述算法。7.根据权利要求1至6中的一项所述的方法，其特征在于，在部分扫描位置(16、21)处扫描所述染料分子(4、5、6)之后更新或重新确定所述扫描规则(17、20)，并且按照更新或重新确定的扫描规则(17、20)继续扫描。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，考虑到在已经扫描的扫描位置(16、21)探测到的所述荧光(34)的所述光子数量或强度，更新或重新确定所述扫描规则(17、20)。9.根据权利要求1至8中的一项所述的方法，其特征在于，对于所述染料分子(4、5、6)的扫描和对于所述网格图像(1)的扫描式采集，使用共同的扫描装置、相同的激发光(25)、共同的光路和/或共同的子光路。10.根据权利要求1至9中的一项所述的方法，其特征在于，所述网格图像(1)是共焦探测的网格图像(1)或用多光子激发、特别是双光子激发记录的具有荧光强度信号或荧光寿命信号的网格图像(1)。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二状态也是荧光状态，所述荧光状态能够以与所述激发光(25)的波长不同的波长选择性地激发，和/或所述第二状态的荧光发射发生在与所述荧光波长范围不同的波长范围...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：阿贝锐纳仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：