本发明专利技术涉及一种用于定位样本(S)中的发射体(F)的方法，方法包括用静止的圆环形激发束(E)照射样本(S)，获取荧光光子；以及根据所获取的荧光光子估计该发射体(F)在该样本(S)中的位置。本发明专利技术还涉及一种用于定位样本(S)中的发射体(F)的设备(1)，该设备包括照明装置(10)、获取装置(20)和处理装置(30)，以及本发明专利技术还涉及一种计算机程序，该计算机程序包括使设备(1)执行用于定位发射体(F)的方法的指令。设备(1)执行用于定位发射体(F)的方法的指令。设备(1)执行用于定位发射体(F)的方法的指令。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于定位样本中的发射体的方法、设备和计算机程序
[0001]本专利技术涉及用于定位样本中的发射体的方法、设备和计算机程序。特别地，该方法可以被应用于在MINFLUX定位中对发射体进行预定位，其中通过根据本专利技术的方法获得的位置估计可以被用作用于MINFLUX定位的起点。
现有技术
[0002]在现有技术中，例如在专利申请DE 10 2011 055 367 A1、WO 2015/052186A1、专利公开DE 10 2013 114 860 B3和Balzarotti F、Eilers Y、Gwosch KC、A、Westphal V、Stefani F、Elf J、Hell SW的“Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes”(arXiv:1611.03401[physics.optics])(2016年)出版物中，已经描述了基于MINFLUX过程的定位和单分子跟踪方法。
[0003]本质上，含有荧光团的样本通过激发光的强度分布来探测，该激发光激发荧光团，触发荧光光子的发射。强度分布具有局部最小值(特别是在分布的中心处具有接近零的强度)，其两侧是最大值。这种分布例如从STED显微术中是已知的，其中形成具有中心最小值的损耗光(depletion light)的强度分布(例如，2D或3D圆环(donut))，以损耗来自偏离中心的荧光团的荧光信号，使超过衍射极限的有效分辨率增加。
[0004]然而，MINFLUX纳米显微术利用了这样的事实，即如果感兴趣的荧光团正好被定位在激发光分布的最小值处，则获得最小荧光信号(理想情况下为零)，而随着分布远离最小值移动，荧光信号增加。在MINFLUX定位中，激发光分布被顺序地定位在靠近荧光团的预期位置的几个位置处(形成所谓的“目标坐标图案(targeted coordinate pattern)”，TCP)，也称为“目标坐标集”，STC)，在这些位置中的每一个处测量荧光信号，并且根据测量的荧光信号和激发光分布的对应位置例如通过最小均方估计器来确定荧光团的位置估计。
[0005]通常迭代该过程，即，通过将激发光分布的最小值放置在前一步骤中获得的位置估计周围的位置处来重复该过程。特别地，最小值被放置在当前位置估计周围的半径内，其中半径在每个步骤中减小，这导致每个步骤中改进的有效分辨率，根据样本和测量参数收敛到低至1nm的值。
[0006]此外，MINFLUX定位具有很高的光子效率，因为随着激发最小值的位置越来越接近荧光团的实际位置，荧光团发射的光越来越少。
[0007]通过使用MINFLUX方案顺序确定若干个单荧光团在样本中的位置，可以构建具有分辨率在1nm范围内的样本的荧光图像。
[0008]在一种称为MINFLUX跟踪的相关技术中，通过针对速度而不是准确度被优化的顺序MINFLUX定位来随时间跟踪单荧光团的轨迹。
[0009]在这两种方法中，激发光束通过诸如电光偏转器的快速光束偏转装置来优先相对于样本被移动到TCP的位置，以减少测量时间。
[0010]为了使用MINFLUX定位或跟踪荧光分子，有必要识别样本中的单荧光团，并获得关
于已识别的单个分子的初始位置信息。然后可以将TCP放置在初始位置估计的附近，并且可以将激发光分布的最小值顺序移动到如上所述的TCP的位置。
[0011]例如，荧光团的初始位置可以通过样本的宽场照明并通过相机的低分辨率荧光检测，例如，以类似于PALM/STORM显微术的方式来被确定。
[0012]这需要能够在宽场照明和具有圆环形激发束的共焦照明之间快速切换的显微系统，这在技术上要求很高，特别是考虑到切换需要在单独的荧光团的每次定位之前发生，这可能显著减慢定位过程。此外，高光子计数对于荧光的相机检测是必要的，因此荧光团必须长期或高强度地暴露于激发光。这要么减慢定位过程，要么承受光漂白和光毒性的危险(在活体样本的情况下)。
[0013]在根据现有技术已知的替代方法中(例如，在Balzarotti F、Eilers Y、Gwosch KC、A、Westphal V、Stefani F、Elf J、Hell SW的“Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes”(arXiv:1611.03401[physics.optics])(2016年)中所公开的)，在样本的感兴趣区域上扫描高斯形激发束，并且由共焦点检测器检测荧光光子，直到光子计数达到预定阈值。在获得阈值光子计数的感兴趣位置处停止扫描。随后，高斯激发束被放置在感兴趣位置周围的几个位置处，并且相应的光子计数由点检测器确定。由于高斯激发束的预定形状和发射(检测)点扩展函数的相应形状，可以根据高斯激发束的位置和相关联的光子计数，例如通过所谓的修正的最小均方估计器来确定荧光团的近似位置。该过程通常与通过以扫描的感兴趣区域为中心的激活激光束对荧光团的光激活相结合，以最大化在感兴趣区域中发现荧光发射体的机会。
[0014]尽管与相机检测相比，这种方法提供了可靠的荧光团预定位，降低了光漂白的危险，但它需要用于两种不同激发束形状(高斯光束和圆环形光束)的光束生成光学器件，在光束形状之间快速切换，并有可能使两个光束快速且高精度地移位(理想情况下使用电光偏转器进行移位)。此外，激发束必须与激活光束精确对准(如果适用)。
[0015]这导致了高度复杂和昂贵的MINFLUX系统。
[0016]问题
[0017]因此，本专利技术的基本目的是提供一种用于定位样本中的发射体的方法，其中所获得的位置估计适于作为用于MINFLUX定位或MINFLUX跟踪的初始位置估计，其最小化所使用的光学仪器的复杂性和成本。
[0018]解决方案
[0019]通过权利要求和说明书的主题，特别是根据权利要求1的方法、根据权利要求12的设备和根据权利要求15的计算机程序来实现该目的。本专利技术的实施例在从属权利要求2至11和13至14中被陈述，并在下文中被描述。
[0020]专利技术描述
[0021]本专利技术的第一方面涉及一种用于定位样本中的发射体的方法，方法包括用静止的圆环形激发束照射样本，获取荧光光子；以及根据所获取的荧光光子估计该发射体在该样本中的位置。
[0022]如本文所使用的，术语“发射体”描述了在用激发光照射时发射光(特别地为发光，更特别地发荧光)的分子或粒子。特别地，发射体可以是可激活的，其中激活将发射体从发
射体不响应于激发光发射荧光的非激活状态转换成发射体响应于激发光发射荧光的激活状态。这种激活可以通过用适当波长(其可以是与激发光相同的波长或与激发光的波长相比不同的波长)和强度的激活光照射发射体来实现。替代地，发射体能够自发地进入激活状态，即本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于定位样本(S)中的发射体(F)的方法，包括：用静止的圆环形激发束(E)照射所述样本(S)，获取荧光光子；以及根据所获取的荧光光子估计所述发射体(F)在所述样本(S)中的位置。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以特定于位置的方式获取所述荧光光子，其中，特别地，所述荧光光子的特定于位置的获取是在图像平面(IP)中执行的，所述图像平面(IP)相对于所述激发束(E)的激发焦点(EF)的平面被共焦地布置。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括将针孔(21)投影到，特别是顺序地投影到第一探测位置(101)，特别是第一目标坐标图案(100)的第一探测位置(101)，其中，特别地针对所述第一探测位置(101)获取所述荧光光子。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述针孔(21)在围绕中心(C)的圆形轨迹(T)上被移动，或者被顺序地放置在圆形轨迹(T)上至少三个所述第一探测位置(101)上，其中，特别地，所述第一探测位置(101)在所述圆形轨迹(T)上被均匀间隔。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述圆环形激发束(E)包括最大值到最大值距离(6)，其中，所述圆形轨迹(T)的直径(d)是所述最大值到最大值距离(6)的50％至120％，特别地是60％至100％，更特别地是70％至90％。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述圆形轨迹(T)的直径(d)是发射光的检测点扩展函数的半高全宽的50％至100％，特别地是60％至80％。7.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其特征在于，使用协同作用的第一扫描器件(16)和第二扫描器件(12)使所述激发束(E)保持静止，特别地其中，所述第一扫描器件(16)是检流计扫描仪和/或所述第二扫描器件(12)是电光扫描仪。8.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其特征在于，重复执行以下步骤：用所述静止的圆环形激发束(E)照射所述样本和获取所述荧光光子，其中，在每次重复中所述圆环形激发束(E)的中心被定位在相应的扫描位置(SP)处，其中，特别地，所述扫描位置(SP)被布置在网格(G)上，更特别地，在六边形网格上，其中，特别地，所述扫描位置(SP)之间的相互距离在所述激发束(E)的激发波长的10％至50％之间。9.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其特征在于，所述荧光光子由包括检测器元件(23)阵列的阵列检测器(22)获取，特别地其中，所述检测器元件(23)是光子计数雪崩二极管。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在第一步骤中由所述阵列检测器(22)获取所述荧光光子，其中，确定所述阵列检测器(22)的所述检测器元件(23)上的由所述荧光光子产生的信号强度分布，并且其中，基于...
【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：阿贝锐纳仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：
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