荧光显微镜系统和方法技术方案

一种用于对包括至少两种不同荧光团的样品(102)进行成像的荧光显微镜系统(100)包括照明系统(104)和光学检测系统(112)，照明系统(104)被配置成发射用于激发荧光团的照明光，光学检测系统(112)被配置成基于由受激荧光团发射的荧光生成样品(102)的图像。荧光显微镜系统(100)还包括控制单元(124)，控制单元被配置成基于不同荧光团中每一种的至少一种特性并基于光学检测系统(112)的至少一个参数和/或照明系统(104)的至少一个参数确定是以并行成像模式还是以顺序成像模式对样品(102)成像。在并行成像模式中，不同荧光团同时成像。在顺序成像模式中，不同荧光团被分成第一组和至少一个第二组，并且第一组荧光团和第二组荧光团被相继成像。团被相继成像。团被相继成像。

【技术实现步骤摘要】
荧光显微镜系统和方法


[0001]本专利技术涉及用于对样品成像的荧光显微镜系统。本专利技术还涉及一种使用荧光显微镜系统对包括至少两种不同荧光团的样品进行成像的方法。

技术介绍

[0002]当用多于一种荧光团制备样品时，经常单独地记录每种荧光团。因为对不同荧光团成像可能需要更换滤光器和修改或切换光源，所以在不同图像的采集之间要经过大量的时间。然而，在许多应用中，这是不期望的。因此，存在能够通过多个激发光源和检测器同时激发和检测两种或更多种荧光团的已知的显微镜系统。然而，荧光团之间的交叉激发和非线性效应，如高强度照明引起的漂白等，会严重影响图像质量。

技术实现思路

[0003]因此，一个目的是提供一种用于对包括至少两种不同荧光团的样品进行成像的荧光显微镜系统和方法，其允许采集高质量的图像。
[0004]前述目的通过一种用于对包括至少两种不同荧光团的样品进行成像的荧光显微镜系统以及一种使用荧光显微镜系统对包括至少两种不同荧光团的样品进行成像的方法来实现。以下描述中限定了有利的实施例。
[0005]所提出的用于对包括至少两种不同荧光团的样品进行成像的荧光显微镜系统包括：照明系统，该照明系统被配置成发射用于激发荧光团的照明光；以及光学检测系统，该光学检测系统被配置成基于由受激荧光团发射的荧光生成样品的图像。该荧光显微镜系统还包括控制单元，该控制单元被配置成基于不同荧光团中的每种荧光团的至少一种特性并且基于光学检测系统的至少一个参数和/或照明系统的至少一个参数来确定是以并行成像模式还是以顺序成像模式对样品进行成像。在并行成像模式中，不同荧光团同时成像。在顺序成像模式中，不同荧光团被分成第一组和至少一个第二组，并且第一组荧光团和第二组荧光团被相继成像。
[0006]不同荧光团中的每种荧光团的特性可以特别地是以下之一：激发光谱、发射光谱、亮度和样品内荧光团的浓度。光学检测系统的参数可以特别地是以下之一：放大率、数值孔径、检测器增益、检测器曝光时间、扫描速度、针孔大小、检测器平均量、检测器方向性、检测光谱、检测滤光器设置和成像模态，例如共焦或宽场成像。照明系统的参数可以特别地是以下之一：光源功率、光源光谱和激发滤光器设置。
[0007]控制单元通过考虑任何数量的这些参数来辅助荧光显微镜系统的用户对样品进行成像，以便决定是以并行成像模式还是以顺序成像模式对样品进行成像。特别地，控制单元检查荧光团的同时激发和成像中误差的常见原因，例如交叉激发、过度激发和发射光谱的重叠。控制单元还确保选择成像模式，该模式允许自动处理所采集的图像数据，例如通过光谱解混。此外，样品的制备和染色、荧光团的曝光时间或者甚至样品中某些蛋白质的表达都对荧光团的行为有影响。因此，通过使成像模式适应具体样品和显微镜系统的当前成像
参数，可以采集高质量的图像，而不需要用户方面的特殊专业知识。
[0008]在优选实施例中，控制单元被配置成基于不同荧光团中的每种荧光团的至少一种特性将不同荧光团分成第一组和至少一个第二组。在此实施例中，不同荧光团被分成不同的组。不同组内的荧光团被同时激发，而不同组被相继激发。通过基于至少一种特性来划分荧光团，此实施例防止了负面影响图像质量的不希望的效应，例如交叉激发和过度激发。例如，通过基于荧光团的激发和发射光谱对荧光团进行分组，防止了不期望的交叉激发。同样，如果荧光团按其亮度分组，可以防止不太亮的荧光团被淹没。在此实施例中，尽可能多的荧光团一起成像，以缩短图像采集的持续时间，同时确保高图像质量。
[0009]在另一个优选实施例中，控制单元被配置成将不同荧光团分成第一组和至少一个第二组，使得每组内不同荧光团的发射光谱具有最小的重叠。在此实施例中，每组内的不同荧光团可以通过光谱解混容易地分离。因此，不同荧光团之间的串扰被最小化。这允许样品以高光谱质量成像。
[0010]在另一个优选实施例中，控制单元被配置成基于不同荧光团中的每种荧光团的至少一种特性和/或样品的至少一种特性来确定照明系统的至少一个光源的功率的最小值和/或最大值，并且通过将光源功率的工作范围与最小值和/或最大值进行比较来确定是以顺序成像模式还是以并行成像模式对样品进行成像。最小值可以由例如激发不同荧光团所需的最小功率来确定。最大值可以根据漂白不同荧光团中的一种或多种所需的功率来确定。
[0011]例如，样品包括可以被不同光源激发的两种荧光团A和B。由于染色中的误差，荧光团A仅被非常微弱地染色，并且需要大量的能量来激发，而荧光团B被非常强烈地染色，并且对激发的响应非常好。用户选择共焦成像并使用自动照明设置。由于荧光团的动态特性(dynamics)差异很大，自动照明设置将导致一个光源被设置为最大值，而另一个光源被设置为最小值。作为交叉激发的结果，荧光团A和B都没有被最佳激发，并且控制单元将建议顺序成像模式。
[0012]在此实施例中，控制单元确定激发但不漂白不同荧光团所需的功率是否在所用的一个或多个光源的工作范围内。换句话说，控制单元被配置成基于照明系统的至少一个光源的动态范围来确定是以顺序成像模式还是以并行成像模式对样品进行成像。
[0013]在另一个优选实施例中，控制单元被配置成基于不同荧光团的激发光谱来确定是以顺序成像模式还是以并行成像模式对样品进行成像。例如，当不同荧光团的激发光谱显著重叠时，不同荧光团可以被相同的激发光激发，因此可以被同时激发。当不同荧光团的激发光谱差别很大时，可能需要两个或更多个光源。然而，多个荧光团的激发也可能是不希望的，特别是当荧光团的发射光谱也存在显著重叠时。这是不期望的，因为不同荧光团在光谱解混期间或使用滤光器设置时很难分离。因此，在该实施例中，控制单元还可以通过比较不同荧光团的光谱，例如通过计算重叠积分、欧几里德距离或光谱角并将结果与预定阈值进行比较，来检查是否可能发生强重叠。因此，该实施例便于光谱解混，并因此进一步提高图像质量。
[0014]在另一个优选实施例中，控制单元被配置成基于照明系统发射的激发光的光谱来确定是以顺序成像模式还是以并行成像模式对样品进行成像。激发光的光谱特别地由光源和/或激发滤光器设置来确定。激发光的光谱决定了不同荧光团中的哪个荧光团可以被激
发。当激发光的光谱与特定荧光团的激发光谱之间没有足够的重叠时，该特定荧光团可能不会被激发光激发。因此，有必要为每种荧光团选择正确的激发光源和/或激发滤光器设置。因此，可能有必要使不同荧光团中的一些相继地成像，以便在并行图像采集之间改变激发光源和/或激发滤光器设置。
[0015]在另一个优选实施例中，控制单元被配置成通过将不同荧光团的激发光谱与照明系统发射的激发光的光谱进行比较来确定是以顺序成像模式还是以并行成像模式对样品进行成像。在该实施例中，控制单元检查一个或多个光源是否“过度激发”荧光团中的一种或多种。由于非线性效应和检测器饱和，这种“过度激发”可能导致样品漂白，并且因此如果不加以考虑的话，会导致图像质量快速下降。
[0016]在另一个优选实施例中，控制单元被配置成基于不同荧光团的发射光谱来本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于对包括至少两种不同荧光团的样品(102)进行成像的荧光显微镜系统(100)，包括：照明系统(104)，所述照明系统(104)被配置成发射用于激发所述荧光团的照明光；光学检测系统(112)，所述光学检测系统(112)被配置成基于由受激荧光团发射的荧光生成所述样品(102)的图像；以及控制单元(124)，所述控制单元(124)被配置成基于所述不同荧光团中的每种荧光团的至少一种特性并且基于所述光学检测系统(112)的至少一个参数和/或所述照明系统(104)的至少一个参数来确定是以并行成像模式还是以顺序成像模式对所述样品(102)进行成像；其中在所述并行成像模式中，所述不同荧光团被同时成像；以及其中在所述顺序成像模式中，所述不同荧光团被分成第一组和至少一个第二组，并且所述第一组荧光团和第二组荧光团被相继成像。2.根据权利要求1所述的荧光显微镜系统(100)，其中，所述控制单元(124)被配置成基于所述不同荧光团中的每种荧光团的至少一种特性将所述不同荧光团分成所述第一组和所述至少一个第二组。3.根据权利要求2所述的荧光显微镜系统(100)，其中，所述控制单元(124)被配置成将所述不同荧光团分成所述第一组和所述至少一个第二组，使得每组内的所述不同荧光团的发射光谱具有最小重叠。4.根据前述权利要求中任一项所述的荧光显微镜系统(100)，其中，所述控制单元(124)被配置成基于所述不同荧光团中的每种荧光团的至少一种特性和/或所述样品(102)的至少一种特性来确定所述照明系统(104)的至少一个光源(106)的功率的最小值和/或最大值，并且通过将所述光源(106)功率的工作范围与所述最小值和/或所述最大值进行比较来确定是以顺序成像模式还是以并行成像模式对所述样品(102)进行成像。5.根据前述权利要求中任一项所述的荧光显微镜系统(100)，其中，所述控制单元(124)被配置成基于所述不同荧光团的激发光谱来确定是以顺序成像模式还是以并行成像模式对所述样品(102)进行成像。6.根据前述权利要求中任一项所述的荧光显微镜系统(100)，其中，所述控制单元(124)被配置成基于由所述照明系统(104)发射的激发光的光谱来确定是以顺序成像模式还是以并行成像模式对所述样品(102)进行成像。7.根据前述权利要求中任一项所述的荧光显微镜系统(100)，其中，所述控制单元(124)被配置成通过将所述不同荧光团的所述激发光谱与由所述照明系统(104)发射的激发光的光谱进行比较来确定是以顺序成像模式还是以并行成像模式对所述样品(102)进行成像。8.根据前述权利要求中任一项所述的荧光显微镜系统(100)，其中，所述控制单元(124)被配置成基于所述不同荧光团的所述发射光谱来确定是以顺序成像模式还是以并行成像模式...

【专利技术属性】
技术研发人员：凯，
申请(专利权)人：莱卡微系统CMS有限责任公司，
类型：发明
国别省市：