估计样品中发射体位置的方法、器件、显微镜和计算机程序技术

本发明专利技术涉及一种用于估计发射体(2)在样品(1)中的位置的方法，该方法包括在一组或更多组探测位置(P

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】估计样品中发射体位置的方法、器件、显微镜和计算机程序
[0001]专利技术的

[0002]本专利技术涉及用于估计样品中发射体的位置的方法、计算机程序和设备。本专利技术还涉及使用这种方法或设备的显微镜。
现有技术
[0003]由于以STED(受激发射损耗)[2]和RESOLFT(可逆饱和光学荧光跃迁)[3]为代表的坐标定向的超分辨率系列[1]及其坐标随机的对应物(包括PALM(光激活定位显微术)/STORM(随机光学重建显微术)[4]和PAINT(纳米级形貌成像的点积累)[5])的特定强度的协同组合，荧光显微术经历了第二次分辨率提升。由此产生的协同概念(称为MINFLUX(最小光子通量)[6])已将STED、PALM/STORM和其他荧光成像和定位技术中普遍存在的分辨率差距从约20nm
‑
30nm缩小到分子本身的1nm
‑
5nm大小尺度。
[0004]在其核心，MINFLUX定位是基于使用结构化光束(例如具有中心强度最小值(即零)的圆环(donut))在样品中注入参考坐标的重要基本原理。样品中零点的位置定义了定向(targeted)样品坐标。MINFLUX概念同样适用于参考坐标(即线状和点状零点)的全部的集合、以及宽场中的并行化检测。坐标定向能够实现荧光分子的良好控制以及因此光子有效的定位，因为要确定的荧光团坐标不再是通过建立出现在相机上的微弱的、衍射受限的荧光点(fluorescence spot)的中心来找到的。更确切地，荧光团是通过主动将激发圆环的零点定向到荧光团来定位的。具体地说，在经过深思熟虑的迭代中，使得激发强度零点尽可能接近分子，直到检测的荧光速率与背景噪声的荧光速率近似匹配。在这种最近的接近度的情况下，只需要最少数量的荧光光子以获得最大的定位精度，因为建立圆环零点所定向的坐标和分子位置之间的剩余距离需要少得多的检测光子。因此，“注入”或定向样品中的参考坐标将需要许多荧光光子进行定位的负担转移到圆环形激发光束中无穷无尽的光子数量。
[0005]由于MINFLUX定位不再受等待大量荧光光子的限制，所以这种纳米精度的定位比PALM/STORM中使用的基于相机的定位要快得多。使用圆环零点光学注入坐标的想法也固有地存在于最初的STED概念中。对于STED显微术，很明显，在没有背景的情况下，单个检测的光子足以证明在圆环零点所定向的坐标处存在荧光团。同样，发射荧光团被STED光束注入的光子完美地定位。
[0006]使用无偏估计器可实现的最小定位精度(即，用于定位位于由定向坐标图案所勾勒的直径为L的区域内的荧光团的Cram
é
r
‑
Rao下界(CRLB))由给出，其中N表示在定向坐标图案的坐标处放置零点的情况下检测的光子的和。虽然对定向坐标图案的直径L的依赖是线性的，但对检测的光子数量N的依赖仅遵循众所周知的逆平方根关系。因此，使激发圆环的零点更接近荧光团位置，即，定向坐标图案的直径L被受控减小，比等待检测光子的更多数量N更有效地提高定位精度。该基本事实是迭代MINFLUX方法的核心，该方法发挥了以下中心思想：使圆环的零点与被探测的荧光团在空间上一致，该过程仅受背景噪声的限制。对于包括一组外三角形加中心探测点的定向坐标图案的一般情况，以逐步减小
的L
k
在分子上连续放大是用于细化位置估计的可行策略，其中L
k
选择为σ
k
‑1的三倍，即前一次迭代中的不确定性。在少量k次迭代之后，并且因此对于每次迭代的相同或相似光子计数的情况下检测的光子的组合N
t
＝k
·
N，CRLB变为：
[0007][0008]已经有四个步骤，即，k＝4，产生即：与对检测的光子的数量N
t
的逆平方根依赖相反的逆二次型。更多的迭代容易产生甚至更高的阶，反映了指数关系。同样重要的是，每次迭代中收集的光子数量不必相同。相反，它们可以在迭代过程中为了其最有效的消耗进行单独调整。
[0009]用于MINFLUX测量的样品优化通常涉及为样品找到正确的成像条件(例如激光功率或缓冲成分)，这通常通过具有调整的参数的连续测量来完成。为了促进该例程并通常提高样品处理量(throughput)，在测量期间即时渲染最终定位数据是非常理想的，因为它允许在测量已经开始后不久就判断样品的质量。
[0010]超分辨率成像的一种可能形式使用具有功率斜坡(power ramping)的迭代MINFLUX成像。该方法通过对数据应用随机估计器，从在一组探测位置(probe position)处测量的光子计数中推导出发射体在样品中的位置。该方法由于以下事实而复杂化：为了获得无偏结果(即没有系统误差的结果)，必须考虑特定的实验条件(例如圆环的空间强度分布，并且特别是信噪比)。到目前为止，定位数据[6]、[7]、[8]的耗时后处理已经考虑到了这些条件。
[0011]根据初始的2D MINFLUX出版物[6]中公开的协议，在每个步骤中在四个位置探测样品，一个位置在与前一步骤中确定的发射体的位置估计一致的中心位置，而三个位置围绕中心布置为等边三角形。虽然三个位置代表在二维中获得关于发射体的位置信息所必需的最小集合，但是添加中心位置被描述为有助于消除位置估计中的模糊性。
[0012]此外，在现有技术[7]中描述的3D MINFLUX过程中，发射体首先通过在发射体的初始位置估计周围的四个点处使用高斯激发焦点进行的激发而在焦平面中横向预定位。然后，利用在估计位置下方和上方的两点处具有局部最小值的激发光分布(3D圆环)来执行轴向预定位。随后，将3D圆环放置在七个位置处，并获得荧光光子计数。3D圆环中心的七个位置的图案包含在焦平面中取向的五个位置：与预期发射体位置一致的一个中心位置和四个等间距的外围点。沿着z轴在焦点的上方和下方布置两个附加位置。
[0013]专利申请DE 10 2016 119 263 A1和DE 10 2016 119 264 A1公开了旨在通过在每个定位步骤中使用最少数量的激发圆环位置来以最小光子数进行高精度定位的MINFLUX方法的变体。DE 10 2016 119 264 A1具体公开了在围绕估计的发射体位置的等边三角形上的三个位置用圆环形激发光束基本上同时照射样品。
[0014]WO 2020/128106 A1公开了一种MINFLUX显微镜，该显微镜包括多个单光源(例如，基于光纤(fiber optics))，该单光源被配置为在样品中生成照射点图案。具体地，描述了笛卡尔(cartesian)和六边形图案，其中，根据示例，照射点可以布置在三角形或正方形的角(corner)处。
[0015]然而，如果出现高水平的背景发射或波动的背景发射，则上述激发光最小值的定向坐标图案的集合和现有技术中描述的对应位置估计器容易出现问题。使用根据现有技术的方法，背景校正需要针对每个信号背景比的数值优化参数。然而，精确的信号背景比通常是未知的或受波动的影响。此外，当使用现有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于估计发射体(2)在样品(1)中的位置的方法，包括在一组或更多组探测位置(P
i
)处用光照射所述样品(1)，针对所述组的探测位置(P
i
)获取光子，特别是荧光光子，根据所获取的光子确定所述组的探测位置(P
i
)的光子计数的矢量或光子计数的和，以及根据所述光子计数的矢量或光子计数的和估计所述发射体(2)的位置，其特征在于，所述一组或更多组探测位置(P
i
)各自包括六个或更多个探测位置(P
i
)，所述六个或更多个探测位置(P
i
)旋转对称地布置在围绕中心的圆上，其中所述一组或更多组探测位置(P
i
)缺少中心探测位置(P
i
)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述探测位置(P
i
)处利用具有邻近最小值(4)的强度增加范围的光分布(3)来照射所述样品(1)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，一组探测位置(P
i
)中的相对探测位置(P
i
)以有序对被照射。4.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其特征在于，执行多次扫描迭代，其中在每次扫描迭代中，在所述一组或更多组探测位置(P
i
)处利用光照射所述样品(1)，针对所述组的探测位置(P
i
)获取光子，特别是荧光光子，根据所获取的光子确定所述组的探测位置(P
i
)的光子计数的矢量或光子计数的和，并且根据所述光子计数的矢量或光子计数的和确定所述发射体(2)的位置估计。5.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括根据所述光子计数的矢量或所述光子计数的和确定表示背景噪声的值，其中特别地，在多次所述扫描迭代中，更特别地，在每次所述扫描迭代中确定所述值。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用表示背景噪声的所述值实时调整估计器(35)，其中，特别地，在多次扫描迭代中，更特别地在每次所述扫描迭代中调整所述估计器(35)。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述估计器(35)用以下方式进行调整：在估计所述发射体(2)的位置之前从光子计数中减去所述背景噪声的预期值，其中特别地，在多次所述扫描迭代中，更特别地在每次所述扫描迭代中从所述光子计数中减去所述背景噪声的所述预期值。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述估计器(35)使用校准多项式，其中特别地，所述校准多项式对于所述多次扫描迭代中的每一次扫描迭代是特定的。9.根据权利要求5至8中的一项所述的方法，其特征在于，所述估计器由矢量和与缩放常数或校准多项式c的乘积来确定，其中是所述探测位置，并且p
j
是相关联的光子计数，其中特别地，所述缩放常数c取决于在上面布置了所述探测位置的圆的半径L，并且所述缩放常数c取决于检测点扩展函数的半高全宽。10.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括预定位步骤，
以在视场中搜索发射体(2)和/或获得所述发射体(2)的初始位置估计，其中，所述预定位步骤包括利用静止的圆环形激发光束照射所述样品(1)，将针孔(30)顺序地投影到所述探测位置(P
i
)，针对所述探测位置(P
i
)获取所述光子，并根据所获取的光子估计所述发射体(2)在所述样品(1)中的位置。11.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，在所述一组或更多组探测位置(P
i
)处由3D圆环(108)照射所述样品(1)，其中，所述方法包括轴向定位步骤(140)和横向定位步骤(130)，并且其中：在所述轴向定位步骤(140)中，所述3D圆环(108)的中心局部最小值被顺序地定位在扫描图案轴上的两个轴向探测位置(115、115
...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：阿贝锐纳仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：