定位样品中染料的单个分子的方法和生成样品中结构的高分辨率图像的方法技术

本发明专利技术涉及用于生成样品中结构的高分辨率图像或用于定位样品中荧光染料的单个分子的方法，以及荧光染料在这种方法中的用途。根据本发明专利技术的方法的特征在于，在用激发光和荧光阻抑光扫描荧光染料之前在光活化反应中首先由受保护的非荧光形式的染料形成荧光染料，该光活化反应包括至少两个反应步骤，并且该受保护的非荧光形式的染料对激发光和荧光阻抑光是惰性的。是惰性的。是惰性的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】定位样品中染料的单个分子的方法和生成样品中结构的高分辨率图像的方法
[0001]专利技术的

[0002]本专利技术涉及用于生成结构的高分辨率图像的方法和用于定位样品中荧光染料的单个分子的方法。为此，用激发光和荧光阻抑光的具有局部最小值的强度分布扫描样品或样品的片段，该荧光阻抑光阻止、减少或完全抑制荧光染料发射荧光。与现有技术中已知的相关方法相比，根据本专利技术的方法的特征在于，在用激发光和荧光阻抑光扫描荧光团之前，在包括至少两个反应步骤的光活化反应中，首先由染料的受保护的非荧光形式形成荧光团，并且染料的受保护的非荧光形式对于激发光和荧光阻抑光是惰性的。
现有技术
[0003]STED显微镜被理解为激光扫描显微镜的方法，该方法能够实现用荧光染料标记的样品的空间上高分辨率的成像。在此，用聚焦的激发光和刺激光扫描样品，其中，激发光和刺激光的强度分布基本上是互补的，并且刺激光的强度分布在激发光的强度最大值的位置处具有零点。在高强度位置，刺激光阻碍荧光染料发射荧光，从而将荧光发射限制在刺激光强度分布的零点周围的一个小范围内，并减小了有效点扩展函数的大小。
[0004]作为STED显微镜的改进方案，在DE 10 2013 100 172 A1中公开了一种用于STED显微镜的方法，其中在用激发光和刺激光照射之前，附加地(就像刺激光一样)用荧光阻抑光的具有局部最小值的强度分布照射测量区域中的样品，该荧光阻抑光使荧光团从荧光状态转变成保护状态，在该保护状态中荧光团被保护以防被激发光和刺激光电子激发。在此，该方法的目标主要不是通过叠加刺激光和荧光阻抑光的强度分布来改进显微镜的分辨率；而是通过激发光和刺激光，特别是在刺激光的高强度区域中，减少荧光团的光漂白，其方式是，使特别是在这些区域中的荧光团转变成不可激发的保护状态，从而得到保护免受激发光和刺激光的漂白作用。使用该方法的前提条件是要有合适的荧光团，该荧光团可以暂时转变成保护状态，即可光切换。在此例如，对切换对比度的要求不如RESOLFT显微镜那么严格，但保护状态对于激发光和刺激光必须(基本上)是惰性的—对于许多可光切换的荧光团来说，这一要求在实践中并没有得到满足或仅不充分地满足。
[0005]在定位显微镜的总称下，用于高分辨率荧光显微镜的其他相关的方法是已知的。这些方法基于单个荧光染料分子的高精度空间定位以及从这些单个分子定位重建高分辨率图像。使用这些方法的前提条件是，荧光染料分子在任何时间点都以单独的形式存在于样品中，即空间上彼此分离的形式存在，因此在相机上成像时在相机图像中显示为单独的对象。虽然例如可以通过在标记样品时使用相应高的染料稀释度来实现空间上分离的荧光染料分子；然而，为了能够生成结构的在空间上尽可能连续的高分辨率成像，需要用许多以高密度布置的荧光染料分子标记结构，并确定这些荧光染料分子的足够大的一部分(典型地数千个荧光染料分子)的位置。荧光染料分子的标记密度必然高，这意味着在定位染料分子期间，所有染料分子中始终仅允许一小部分以荧光状态存在，以便能够满足荧光分子单独且空间上孤立地存在的要求。因此，在定位显微镜中使用可光切换的荧光染料，该荧光染
料具有荧光状态，在荧光状态中，染料可以用合适波长的激发光激发出荧光，并且还具有暗状态，在暗状态中，染料不能用激发光激发出荧光。在此，染料可以被光活化至少一次，即从暗状态转变成荧光状态。光活化通常以光诱导(lichtinduziert)的方式进行，即通过用合适波长(通常在蓝紫光谱范围内)的光活化光来照射，由此可以精确地调节和控制光活化的染料分子的比例。可替代地，染料分子也可以自发地转变成活化状态。根据荧光染料的类型，活化也可以是可逆的，即可以经历多个活化
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去活化
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切换周期，其中去活化或者向非荧光状态的转变也可以光诱导地或自发地进行。典型的切换机制是从荧光状态到瞬态暗状态(例如到三重态)的(可逆)转变。特别地，这些转变的切换动力学可以在样品中通过溶剂组成、添加氧化还原试剂和/或控制氧浓度来适应相应的要求。
[0006]在定位显微镜中可达到的定位精度取决于多个因素，并且例如由R.E.Thompson等人在Biophys.J.82,2775(2002)给出：
[0007][0008]其中，s为显微镜的近似为高斯函数的PSF的宽度(标准偏差)，N为探测到的染料分子的荧光光子数，a为探测器像素的边缘长度以及b为由背景荧光和探测器噪声组成的背景信号。
[0009]只要定位精度不受探测器像素的大小a或者背景信号b的明显限制，等式(1)表明，在较小宽度s的(有效)PSF下，对于给定的光子数N，可以获得更高的定位精度或者较小的定位不确定性σ，或者用较低光子数N可以获得理想的定位精度。例如，更窄的有效PSF(具有更小的值s)可以通过以下方式生成：样品不是用均匀分布的激发光平面式地照射，而是类似于STED显微镜，用借助于扫描装置扫描图像场的聚焦的激发光和刺激光照射。在此，刺激光的具有局部强度最小值的强度分布被叠加在高斯形的激发焦点上，这抑制了在激发焦点的边缘区域中的荧光发射，从而减小了有效PSF的宽度s。由于整个图像场的扫描照射自然比平面式的宽视场照射慢，因此在某些情况下必须调整记录方案，使得不是将图像场作为整体进行扫描，而是片段地进行扫描，其中例如选择片段，使得该片段分别包含一个荧光染料分子。
[0010]首次由F.Balzarotti等人在arXiv1611.03401[physics.optics]中描述的较新的MINFLUX纳米镜结合了上述方法的特征。在此，用激发光的具有强度最小值的强度分布在一系列不同位置处照射空间上孤立的荧光分子。对于每个照射位置，记录由激发光激发的荧光发射，并从所记录的荧光的强度值的量推断出荧光分子的位置。当然，该位置确定具有不确定性，其中该位置确定的不确定性可以通过迭代地应用该方法来减小。为此，在每次迭代步骤之前调整照射位置，即更接近分子的相应假定的位置。同时增强激发光的强度，使强度梯度在强度最小值附近增大。可替代地，可以增加测量持续时间，这相当于以有效光量计算的激发光强度的增加。利用调整后的参数，在调整后的每个照射位置处依次照射分子，并记录对荧光发射的强度。根据荧光信号对强度最小值位置的依赖性，当前可以以比之前更低的不确定性确定分子的位置。这些方法步骤可以重复进行，直至位置确定收敛或直至达到另一中断标准，例如预先确定的最大可接受的不确定性。MINFLUX方法可实现的定位精度约为1nm，根据目前的技术水平，MINFLUX方法代表了最精确的商业化荧光分子定位方法。
[0011]文献WO 2015/097000 A1进一步公开了从各个分子的位置数据可以获得样品中分子分布的(高分辨率的)图像(“MINFLUX成像”)。该方法对应于通常从定位显微镜中已知的用于从单个荧光分子的多个位置测定中生成高分辨率图像的方法，但在MINFLUX纳米镜的情况下，图像的空间分辨率进一步提高至5nm或更高。
[0012]在DE 10 2017 104 736 B3中描述了MINFLUX本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于定位样品中荧光染料(5)的单个分子(24)的方法，包括以下方法步骤：选择荧光染料(5)，通过用活化光(7)照射所述荧光染料(5)使所述荧光染料(5)能够从受保护的非荧光形式(6)转变成活化的荧光形式(8)，第一组方法步骤包括以下步骤：通过用活化光(7)照射，使所述荧光染料(5)的彼此间隔开最小距离d的一个或更多个分子(24)从所述受保护的非荧光形式(6)光活化成所述活化形式(8)，确定一个或更多个活化的染料分子(5、8、24)的初始位置估计值(26)，所述初始位置估计值的不确定性不大于d/2，在所述样品中形成激发光(16)的强度分布和荧光阻抑光(18)的强度分布，其中至少所述荧光阻抑光(18)的强度分布具有局部强度最小值，其中所述激发光(16)的强度分布也能够具有强度最小值；以及第二组方法步骤包括以下步骤：用具有强度最小值的强度分布(17)之一在一系列的扫描位置(19)处扫描所述样品或所述样品的片段(3)，所述一系列包含分别具有至少两个扫描位置(19)的子集，所述至少两个扫描位置在与所述子集相关联的活化的染料分子(5、8、24)的所述位置估计值(26)周围以小于d/2的距离(25)布置，在所述一系列的每个扫描位置(19)处，探测荧光的光子数或强度，并且将所述光子数或所述强度与相应的扫描位置(19)相关联，从所述荧光的相关联的光子数或强度以及所述扫描位置(19)确定与子集相关联的所述活化的染料分子(5、8、24)中每一个的新的位置估计值(26)，其中，d的值是使得所述初始位置估计值(26)能够明确地与所述活化的荧光染料分子(5、8、24)相关联，并且在每个扫描位置(19)处所探测的荧光在每种情况下仅分别来自所述荧光染料(5)的单个活化的分子(8、24)，其特征在于，选择所述荧光染料(5)，使得所述光活化包括至少两个相应的光诱导的反应步骤(11)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，d≥250nm。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述激发光(16)的强度分布具有局部强度最小值，并且用所述激发光(16)的强度分布(17)扫描所述样品或所述样品的片段(3)。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述激发光(16)的强度分布(15)具有局部强度最大值，其中所述荧光阻抑光(18)的强度分布和所述激发光(16)的强度分布基本上彼此互补。5.根据权利要求1至4中的一项所述的方法，其特征在于，用两种强度分布进行所述扫描。6.根据权利要求1至5中的一项所述的方法，其特征在于，所述一系列的扫描位置中的扫描位置(19)被布置在圆形路径、螺旋路径(28)或球壳上。7.根据权利要求1至6中的一项所述的方法，其特征在于，重复地执行所述第二组方法步骤。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述重复之间所述激发光(16)和/或所述荧光阻抑光(18)的具有局部强度最小值的强度分布(17)的总强度增加，并且所述子集的
扫描位置(19)朝向相关联的活化的荧光分子(5、8、24)的相应的当前的位置估计值(26)移动。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，最后确定的位置估计值(26)在至少一个空间方向上的不确定性至多为d/10，并且优选地至多为d/30。10.根据权利要求1至9中的一项所述的方法，其特征在于，跟踪所述荧光染料(5)的单个分子(24)在样品中的运动。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在两次重复之间所述激发光(16)和/或所述荧光阻抑光(18)的具有局部强度最小值的强度分布(17)的总强度减小，并且所述子集的扫描位置(19)朝向通过时间外推法确定的相关联的活化的荧光分子(5、8、24)的位置估计值(26)移动。12.根据权利要求1至9中的一项所述的方法，其特征在于，整体上重复执行所述第一组方法步骤和所述第二组方法步骤，其中在所述重复之间使相应的活化的染料分子(5、8、24)转变成非荧光状态。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，从所述荧光染料(5)的单个分子(24)的定位，重建所述样品中结构(4)的空间上高分辨率图像。14.一种用于定位样品中荧光染料(5)的单个分子(24)的方法，包括以下方法步骤：选择荧光染料(5)，通过用活化光(7)照射所述荧光染料(5)使所述荧光染料(5)能够从受保护的非荧光形式(6)转变成活化的荧光形式(8)，以及一组方法步骤，包括以下步骤：通过用活化光(7)照射，使所述荧光染料(5)的彼此间隔开最小距离d的一个或更多个分子(24)从所述受保护的非荧光形式(6)光活化成所述活化形式(8)，在所述样品中形成激发光(16)的强度分布和荧光阻抑光(18)的强度分布，其中所述荧光阻抑光(18)的强度分布(17)具有局部强度最小值，用所述荧光阻抑光(18)的具有强度最小值的强度分布(17)在一系列扫描位置(19)处扫描所述样品或所述样品的片段(3)，所述扫描位置彼此间隔开的距离不大于d/2；在所述一系列的每个扫描位置(19)处，探测荧光的光子数或强度，并且将所述光子数或所述强度与相应的扫描位置(19)相关联，根据所述荧光的相关联的光子数或强度以及所述扫描位置(19)定位活化的染料分子(5、8、24)，该定位在至少一个空间方向上的不确定性至多为d/10。其中，d的值是使得在每个扫描位置(19)处所探测的荧光仅来自所述荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：阿贝锐纳仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：