一种检测NSCLC标志物CYFRA21-1上转换荧光测试试剂盒、制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测NSCLC标志物CYFRA 21

【技术实现步骤摘要】
一种检测NSCLC标志物CYFRA 21
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1上转换荧光测试试剂盒、制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种基于ATRP信号放大策略构建的检测NSCLC标志物CYFRA21
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1上转换荧光测试试剂盒、制备方法和应用，属于生物分析


技术介绍

[0002]肺癌是一种常见的呼吸系统恶性肿瘤，也是全球癌症相关死亡的最主要原因。研究表明，到2025年我国每年因肺癌死亡人数预计可达100万。肺癌病理分为小细胞肺癌(small cell lung cancer)和非小细胞肺癌(non
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small cell lung cancer)，其中非小细胞肺癌约占肺癌的85％。肺癌的早期诊断是提高肺癌患者生存率、改善预后的关键。血清标志物在肺癌的早期诊断中具有重要意义。用于小细胞肺癌(SCLC)筛查、诊疗效果评估的标志物主要有神经元特异性烯醇化酶(NSE)、癌症胚胎抗原(CEA)、鳞状细胞癌抗原(SCC)等，而CYFRA21
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1(细胞角蛋白19可溶性片段)是非小细胞肺癌最有价值的血清肿瘤标志物，尤其对鳞状细胞癌患者的早期诊断、疗效观察、预后监测有重要意义。因此，发展稳定、高效的检测CYFRA21
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1含量的方法，有望能够提高肺癌潜在患者的早诊率。
[0003]目前，传统的检测血清标志物的方法有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等，但由于成本高，操作复杂，灵敏度低，难以用于实际检测。近年来，随着生物医学技术的迅速发展，荧光标记技术因其灵敏度高、操作简便等特点，在生物检测领域得到了广泛的应用。传统的荧光分子为下转换发光，如荧光蛋白、量子点和有机荧光染料。然而，这些荧光分子常伴随着重叠的激发和吸收光谱，导致在应用过程中会有明显的光漂白和光闪烁现象，不能很好的应用于复杂样本的分析。上转换材料(UCNPs)作为一种新型的纳米发光材料，具有和传统染料不同的发光机制，属于反斯托克斯发光。UCNPs具有优异的光学性能，如光稳定性好、生物毒性低、发光强度高、不易漂白，荧光寿命长等，但基于传统目标
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信号1:1比例的方法限制了荧光生物探针的灵敏度和适用性。ATRP反应是一种生物分子动态增长的过程，它利用聚合作用使信号分子在生物识别位点上聚集形成长链聚合物，将单个生物分子识别过程通过链式生长方式扩大数百倍，从而有效放大生物检测信号。因此本专利技术采用了ATRP信号放大策略来提高荧光测试试剂盒的灵敏度。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种基于ATRP信号放大策略构建的检测NSCLC标志物CYFRA21
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1上转换荧光测试试剂盒、制备方法和应用，其操作简单，且信号得到成倍的放大，提高了检测的灵敏度，同时具有良好的稳定性、选择性和和重现性。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案之一是：
[0006]一种基于ATRP信号放大策略构建的检测NSCLC标志物CYFRA 21
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1上转换荧光测试试剂盒，包括以下原料：羧基磁珠、UCNPs、Ab1、Ab2、BIBA、HEMA、CuBr2、ME6TREN、AA、BSA、NHS、EDC、PBS缓冲液。
[0007]进一步，部分原料使用时需配制成溶液，其中，UCNPs溶液浓度为5mg/mL，Ab1溶液浓度为1μg/mL，Ab2溶液浓度为4μg/mL，BIBA溶液浓度为30mM，HEMA溶液浓度为60mM，CuBr2/ME6TREN溶液中CuBr2和ME6TREN浓度均为10mM，AA溶液的浓度为2mM，BSA溶液浓度为10mg/mL，NHS溶液浓度为50mM，EDC溶液浓度为200mM。
[0008]进一步，所述UCNPs为NaYF4:Er,Yb。
[0009]本专利技术的技术方案之一是：一种检测NSCLC标志物CYFRA 21
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1的方法，包括以下步骤：
[0010](1)将BIBA活化之后，连接Ab2，制得Ab2‑
BIBA；
[0011](2)将UCNPs活化之后，连接HEMA，制得UCNPs/HEMA；
[0012](3)活化羧基磁珠，之后连接Ab1，孵育；
[0013](4)封闭步骤(3)之后磁珠上未反应活化位点；
[0014](5)添加待检测样品，孵育；
[0015](6)加入步骤(1)连接好的Ab2‑
BIBA，孵育；
[0016](7)加入步骤(2)连接好的UCNPs/HEMA、CuBr2/ME6TREN溶液、AA溶液，孵育；
[0017](8)将步骤(7)清洗之后的磁珠，分散在PBS缓冲液中，测试发射光谱。
[0018]进一步，具体方法为：
[0019](1)连接ATRP反应的引发剂BIBA和Ab2[0020]①
量取250μL的BIBA溶液，加入NHS溶液和EDC溶液各250μL，放入摇床中振摇反应过夜；
[0021]②
在上述步骤
①
溶液中加入250μL的Ab2溶液，放入摇床中振摇反应2h，制得Ab2‑
BIBA溶液；
[0022](2)连接UCNPs和单体HEMA
[0023]①
量取250μL的UCNPs溶液，加入NHS溶液和EDC溶液各250μL，放入摇床中振摇反应过夜；
[0024]②
在上述步骤
①
溶液中加入250μL HEMA溶液，放入摇床中振摇反应2h，制得UCNPs/HEMA溶液；
[0025](3)修饰Ab1[0026]①
量取20μL羧基磁珠溶液，加入PBS缓冲液，进行清洗，磁力分离，去上清液，将洗好的磁珠分散在PBS缓冲液中，加入NHS溶液和EDC溶液各20μL，放入摇床中振摇反应过夜；
[0027]②
步骤
①
的反应液磁力分离，去上清液，加入PBS缓冲液清洗，洗好后分散在PBS缓冲液中，然后加入20μL Ab1溶液，放入摇床中振摇反应1h；
[0028](4)封闭位点
[0029]将步骤(3)反应液磁力分离，去上清液，加入PBS缓冲液清洗，洗好后分散在PBS缓冲液中，然后加入20μL BSA溶液，放入摇床中振摇反应0.5h；
[0030](5)修饰目标物
[0031]将封闭好的步骤(4)反应液磁力分离，去上清液，加入PBS缓冲液清洗，洗好后分散在PBS缓冲液中，加入20μL待检测溶液，放入摇床中振摇反应1h；
[0032](6)修饰Ab2[0033]将步骤(5)反应液磁力分离，去上清液，加入PBS缓冲液清洗，洗好后分散在PBS缓
冲液中，加入步骤(1)连接好的Ab2‑
BIBA溶液20μL，放入摇床中振摇反应1h；
[0034](7)ATRP反应
[0035]将步骤(6)反应液磁力分离，去上清液，加入PBS缓冲液清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于ATRP信号放大策略构建的检测NSCLC标志物CYFRA 21
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1上转换荧光测试试剂盒，其特征在于，包括以下原料：羧基磁珠、UCNPs、Ab1、Ab2、BIBA、HEMA、CuBr2、ME6TREN、AA。2.根据权利要求1所述的基于ATRP信号放大策略构建的检测NSCLC标志物CYFRA21
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1上转换荧光测试试剂盒，其特征在于，还包括BSA、NHS、EDC、PBS缓冲液。3.根据权利要求1或2所述的基于ATRP信号放大策略构建的检测NSCLC标志物CYFRA21
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1上转换荧光测试试剂盒，其特征在于，部分原料使用时需配制成溶液，其中，UCNPs溶液浓度为5mg/mL，Ab1溶液浓度为1μg/mL，Ab2溶液浓度为4μg/mL，BIBA溶液浓度为30mM，HEMA溶液浓度为60mM，CuBr2/ME6TREN溶液中CuBr2和ME6TREN浓度均为10mM，AA溶液的浓度为2mM，BSA溶液浓度为10mg/mL，NHS溶液浓度为50mM，EDC溶液浓度为200mM。4.根据权利要求1所述的基于ATRP信号放大策略构建的检测NSCLC标志物CYFRA21
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1上转换荧光测试试剂盒，其特征在于，所述UCNPs为NaYF4:Er,Yb。5.一种检测NSCLC标志物CYFRA21
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1的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将BIBA活化之后，连接Ab2，制得Ab2‑
BIBA；(2)将UCNPs活化之后，连接HEMA，制得UCNPs/HEMA；(3)活化羧基磁珠，之后连接Ab1，孵育；(4)封闭步骤(3)之后磁珠上未反应活化位点；(5)添加待检测样品，孵育；(6)加入步骤(1)连接好的Ab2‑
BIBA，孵育；(7)加入步骤(2)连接好的UCNPs/HEMA、CuBr2/ME6TREN溶液、AA溶液，孵育；(8)将步骤(7)清洗之后的磁珠，分散在PBS缓冲液中，测试发射光谱。6.根据权利要求5所述的检测NSCLC标志物CYFRA21
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1的方法，其特征在于，具体方法为：(1)连接ATRP反应的引发剂BIBA和Ab2①
量取250μL的BIBA溶液，加入NHS溶液和EDC溶液各250μL，放入摇床中振摇反应过夜；
②
在上述步骤
①
溶液中加入250μL的Ab2溶液，放入摇床中振摇反应2h，制得Ab2‑

【专利技术属性】
技术研发人员：杨怀霞，马乐乐，刘艳菊，侯梦园，高海洋，
申请(专利权)人：河南中医药大学，
类型：发明
国别省市：