重组人甲状旁腺激素(1-84)非融合表达及规模化制备方法技术

重组人甲状旁腺激素（１－８４）非融合表达及规模化制备方法，本发明专利技术属于基因工程，包括发酵培养基、发酵参数、菌体收集、重组人甲状旁腺激素蛋白提取与纯化以及该蛋白的生物活性检测，本发明专利技术诱导表达起始时间为８小时，一次发酵时间为１２小时，所收获湿菌重量与发酵液体积比为２１．４ｇ∶１Ｌ，重组人ＰＴＨ（１－８４）表达量约占菌体总量的２５％；经层析柱纯化可获得大于９５％的纯度，得率约为湿菌１０ｍｇ／Ｌ发酵液，并建立了ＯＤ４５０ｎｍ条件下重组人ＰＴＨ（１－８４）蛋白与ｃＡＭＰ浓度关系方程。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
重组人甲状旁腺激素（１－８４）非融合表达及规模化制备方法，包括：　（１）用双顺反子表达方式合成的重组人甲状旁腺激素（１－８４）编码基因；　（２）将该基因转入受体细胞内构造宿主细胞并在适宜条件下进行培养，经筛选建立表达重组人甲状旁 腺激素（１－８４）的种子菌；　（３）取种子菌液在培养基Ｒ２及配料的发酵罐内按下列参数发酵：　培养温度３０℃，ｐＨ值６．８～７．２，罐压为常压，通气量、转速与溶解氧联动，溶氧为５０％－１００％；　其特征是：　（４）将８ ００ｍｌ种子菌液加入１５升发酵罐，该发酵罐内培养基为１４升，封罐发酵３小时后流加葡萄糖，ｐＨ值为７．０－７．２，发酵８小时后加入０．５ＭＩＰＴＧ，ＩＰＴＧ终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ，升温至３７℃，补加酵母抽提物和酸水解干酪素，诱导表达４小时至菌体停滞生长，离心收集菌体保存；　（５）纯化工艺：　ａ．用１４升发酵液收集菌体后得到约３００ｇ的湿菌，菌体按１ｇ／ｍｌ用量抽提液（１Ｎ　ＨＣｌ／１％ＮａＣｌ／１％ＴＦＡ）进行抽提，离心收集上清，沉淀中再加入３００ｍｌ的抽提液，重复 ３次，合并收集的上清液；　ｂ．将收集的上清液用Ｔｒｉｓ．Ｃｌ稀释６－８倍上样至用Ｔｒｉｓ．Ｃｌ平衡的ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ／ＢＰＧ柱（１００ｍｍ×２５０ｍｍ），用Ｔｒｉｓ．Ｃｌ冲平基线，收集穿透峰，其中，Ｔｒｉｓ．Ｃｌ的ｐＨ值为７． ５－８．５；　ｃ．将所得穿透峰用盐酸调ｐＨ至６．０－７．５，上至用Ｔｒｉｓ．Ｃｌ平衡的ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ／ＢＰＧ柱（１００ｍｍ×２５０ｍｍ），用ｐＨ值为６．０－７．５的Ｔｒｉｓ．Ｃｌ冲平基线，收集穿透峰；　ｄ．将收集的穿透 峰加入ＮａＣｌ，使其终浓度为１Ｍ，用ＮａＯＨ调ｐＨ至７．０－８．０，上样至用１Ｍ铵盐、ｐＨ＝７．０－８．０平衡的Ｂｕｔｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ／ＢＰＧ疏水柱（１００ｍｍ×２００ｍｍ），用ｐＨ７．０－８．０、１Ｍ铵盐冲平基线，以ｐＨ７．５、１Ｍ铵盐为Ａ液，ｐＨ７．０－８．０的ｄＨ２０为Ｂ液，梯度洗脱蛋白，收集各洗脱峰，洗脱参数为：Ｔａｒｇｅｔ＝１００％、Ｌｅｎｇｔｈ＝１２０ｍｉｎ；　ｅ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测目的蛋白，收集目的蛋白洗脱峰，超滤浓缩１０倍后上至用缓冲液１０ｍＭ 　ＰＢＳ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２平衡好的凝胶过滤柱Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－７５（３５ｍｍ×１３００ｍｍ），流速为５ｍｌ／ｍｉｎ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李鸿钧，唐维坤，孙茂盛，何昆云，王文举，蒋琳，杨蕾，严敏，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，昆明云健制药有限公司，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]