一种几丁质脱乙酰基酶突变体、重组表达载体、重组工程菌及其筛选方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种几丁质脱乙酰基酶突变体、重组表达载体、重组工程菌及其筛选方法。本发明专利技术首先通过对出发模板几丁质脱乙酰基酶CdaBa进行二硫键设计，获得2对有效的二硫键突变体。通过对出发模板几丁质脱乙酰基酶CdaBa进行理性单点突变，获得4个有效单点突变体。最后将2对有效的二硫键突变体和4个有效的单点突变体进行组合突变，进一步筛选获得最佳突变体CdaBaM；这种突变体进一步应用于重组载体及重组菌株的制备过程。采用本发明专利技术方法制得的突变体CdaBaM在70℃热处理30分钟和60分钟，剩余酶活分别为87.4％和52.8％，是出发模板几丁质脱乙酰基酶CdaBa的5.8倍和10.4倍。5.8倍和10.4倍。5.8倍和10.4倍。

【技术实现步骤摘要】
一种几丁质脱乙酰基酶突变体、重组表达载体、重组工程菌及其筛选方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种几丁质脱乙酰基酶突变体、重组表达载体、重组工程菌及其筛选方法。

技术介绍

[0002]虾蟹作为主要水产品，在加工业中，通常只取虾蟹的肉，剩下则作为加工副产品。研究表明虾蟹加工副产物主要包括几丁质、蛋白质和无机盐，其中几丁质含量约为20％。几丁质作为一种由N
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乙酰氨基葡萄糖以β
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1,4糖苷键连接而成的多糖，由于溶解性很差，导致其应用价值有限。研究发现几丁质脱去乙酰基团转化为壳聚糖后，溶解性得到有效改善，可以很好的溶于稀酸，从而在农业、食品等领域具有良好的应用价值。
[0003]目前几丁质脱乙酰基的主流加工方式是化学浓碱法，在高浓度碱条件下，几丁质容易脱去乙酰基团。化学法虽然高效，但是具有很多缺点如：破坏几丁质的结构、脱乙酰过程很难精准控制、反应排放物对环境污染严重等，因此寻找绿色高效的加工方法具有重要意义。国内外科学家发现几丁质脱乙酰基酶能够定向水解几丁质的乙酰基团形成壳聚糖。相比于化学法，几丁质脱乙酰基酶作用过程具有绿色环保、反应条件温和、反应过程及产物结构可控等。在前期的研究中我们发现Bacillus atrophaeus几丁质脱乙酰基酶CdaBa具有良好的活性，能够高效催化几丁质转变为壳聚糖。但是几丁质脱乙酰基酶CdaBa热稳定性较差，限制其产业化应用。因此提升几丁质脱乙酰基酶CdaBa的热稳定性能够提升其稳定性以及催化性能，为其产业化应用奠定基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术以Bacillus atrophaeus几丁质脱乙酰基酶CdaBa为研究对象，通过二硫键设计、理性定点突变以及组合突变获得热稳定性提升的突变体CdaBaM为其下一步的产业化应用奠定基础。
[0005]本专利技术采用的具体方案如下：
[0006]一种几丁质脱乙酰基酶突变体CdaBaM，突变体CdaBaM的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]GPRLEPIKESASLSEQMQKEKNKNSAKKQDEQKTSPEIGKVVYLTFDDGCHPAASEEIMNLLHKYNCKGTFFMLKPNIVQNPDCVKKMVESGHSVGSHGVTHKVFEIYKSPDSFATEMNDTLDFIKEYTKVNTHLIRAPYGSKPYITGPFREVVKRNQFNLWDWTVDSEDWKYTHGEFIKNTIQQVLNLVGKEPLVVLMHEKPMTAAYLGELLKYFRESGYECKAIDDSIKPVQFRFN(SEQ ID NO.1)；
[0008]优选地，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]GGTCCAAGGCTTGAACCAATAAAAGAAAGTGCCTCCCTTTCTGAGCAGATGCAAAAAGAAAAGAATAAAAATTCAGCAAAGAAACAGGATGAACAAAAAACATCACCTGAAATTGGAAAGGTGGTCTATTTAACATTTGATGAT
GGATGTCATCCTGCTGCTTCAGAGGAGATTATGAATTTACTCCATAAATACAATTGTAAAGGAACATTTTTTATGTTAAAACCTAATATCGTGCAAAATCCAGATTGTGTTAAGAAAATGGTAGAAAGCGGTCACTCTGTTGGGTCTCACGGCGTGACGCATAAGGTGTTCGAAATCTATAAATCCCCTGATAGCTTTGCGACAGAAATGAACGATACGCTTGACTTTATCAAAGAATATACCAAAGTCAACACACATTTGATAAGAGCACCTTACGGGTCTAAGCCGTACATTACTGGCCCATTTAGAGAAGTTGTTAAGCGTAACCAATTTAATCTCTGGGATTGGACAGTTGATTCAGAAGACTGGAAGTACACTCATGGAGAATTTATAAAAAATACAATTCAGCAAGTACTCAATCTTGTAGGGAAAGAACCACTTGTTGTGTTAATGCACGAAAAACCGATGACTGCGGCATATTTAGGAGAATTATTAAAATATTTCCGAGAAAGCGGCTACGAATGTAAAGCAATTGATGATTCAATAAAGCCGGTACAATTCAGATTCAAC(SEQ ID NO.2)；
[0010]本专利技术还提供了一种重组表达载体pPICZαA
‑
cdabam，包含编码所述几丁质脱乙酰基酶突变体CdaBaM的多聚核苷酸序列。
[0011]本专利技术还提供了一种重组工程菌，包含所述的重组表达载体pPICZαA
‑
cdabam。
[0012]优选地，所述重组工程菌以毕赤酵母工程菌作为宿主。
[0013]优选地，所述毕赤酵母工程菌包括毕赤酵母X33。
[0014]本专利技术还提供了一种所述重组工程菌的筛选方法，包括如下步骤：
[0015]S1、将表达载体pPICZαA
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cdabam线性化后转入毕赤酵母，电转后的转化子涂布于高浓度YPDZ平板上；
[0016]S2、采用24孔板法挑选96个重组转化子进行初步筛选；
[0017]S3、将初步筛选获得高酶活转化子进行摇瓶培养复筛；
[0018]S4、将摇瓶培养筛选出来的转化子进行高密度发酵验证。
[0019]优选地，步骤S1所述高浓度YPDZ平板中博莱霉素的浓度大于500mg/L。
[0020]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：(1)分析几丁质脱乙酰基酶CdaBa三维构象，找到蛋白柔性区域，通过构建和筛选获得有效二硫键突变体；(2)分析几丁质脱乙酰基酶CdaBa三维构象，理性设计定点突变体，获得有效单点突变体；(3)将有效二硫键突变体和单点突变体进行叠加组合，获得最佳突变体CdaBaM；(4)突变体CdaBaM在毕赤酵母高效制备；(5)突变体CdaBaM特性表征。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：
[0022]本专利技术以几丁质脱乙酰基酶CdaBa为出发模板，通过二硫键设计、单点突变、组合突变等过程获得最佳突变体CdaBaM。采用本专利技术方法制得的突变体CdaBaM在70℃热处理30分钟和60分钟后，剩余酶活分别为87.4％和52.8％，是出发模板几丁质脱乙酰基酶CdaBa的5.8倍和10.4倍，同时突变体CdaBaM在毕赤酵母X33的高效表达，为其下一步产业化应用奠定了坚实基础。
附图说明
[0023]图1为几丁质脱乙酰基酶CdaBa三维构象(A)及构象评估拉式图(B)；
[0024]图2为有效二硫键突变体最适反应温度(A)和热稳定性图(B)；
[0025]图3为有效单点突变体最适反应温度(A)和热稳定性图(B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种几丁质脱乙酰基酶突变体CdaBaM，其特征在于，突变体CdaBaM的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述几丁质脱乙酰基酶突变体CdaBaM，其特征在于，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种重组表达载体pPICZαA
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cdabam，其特征在于，包含编码权利要求2所述几丁质脱乙酰基酶突变体CdaBaM的多聚核苷酸序列。4.一种重组工程菌，其特征在于，包含权利要求3所述的重组表达载体pPICZαA
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cdabam。5.如权利要求4所述的重组工程菌，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建荣，祝木金，陈微，王平，钟斌，陈孟林，高美芳，曹革，
申请(专利权)人：深圳润康生态环境股份有限公司，
类型：发明
国别省市：