一种热稳定性增强的胆盐水解酶以及制备与方法和应用技术

本发明专利技术涉及酶工程技术领域，具体涉及一种热稳定性增强的胆盐水解酶以及制备与方法和应用。热稳定性增强的胆盐水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，热稳定性增强的胆盐水解酶是野生型酶的第80位的甘氨酸突变成丙氨酸。本方案通过基因突变的手段，改变了分子表面的疏水性，解决了现有的胆盐水解酶的热稳定性不高的技术问题。本方案的胆盐水解酶适用于大规模生产的胆盐水解酶，所获得的胆盐水解酶具有热稳定性高的特点，可以增加酶的适用场景，拓宽了胆盐水解酶工业化应用的范围。宽了胆盐水解酶工业化应用的范围。宽了胆盐水解酶工业化应用的范围。

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性增强的胆盐水解酶以及制备与方法和应用


[0001]本专利技术涉及酶工程
，具体涉及一种热稳定性增强的胆盐水解酶以及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]酶的热稳定性是酶的重要属性之一，高热稳定性的酶一直是酶工程领域的研究热点。获得具有高热稳定的酶对于提高酶催化反应效率，简化催化工艺以及降低基于酶催化反应的生产成本等，都具有非常重要的意义。在研发新型的酶制剂的过程中，酶的热稳定性是衡量酶制剂的品质和应用范围的重要指标。
[0003]胆盐水解酶(bile salt hydrolase BSH)普遍存在于哺乳动物的胃肠道菌群中，能够水解结合型胆盐，使其生成氨基酸和游离态胆汁酸，从而降低血清中的胆固醇含量。在生物循环中，胆汁酸作为一种信号物质参与了机体脂质、胆固醇和糖的生化代谢及调节，改变胆汁酸的组成和流量可以作为一种治疗代谢综合症的新方向。对于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)来源的胆盐水解酶，目前对该酶分子的具有热稳定作用的氨基酸残基或肽段的研究还不充分，无法获得可用于定点突变增加酶热稳定性的关于酶分子结构的信息，导致难以获得热稳定性明显提升的突变体。亟需开发一种新的适用于工业大规模生产的热稳定性高的胆盐水解酶，从而提高酶制剂的品质和拓宽其应用范围。

技术实现思路

[0004]本专利技术意在提供一种热稳定性增强的胆盐水解酶，以解决现有的胆盐水解酶的热稳定性不满足应用需求的技术问题。
[0005]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
>[0006]一种热稳定性增强的胆盐水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0007]本方案的原理及优点是：本方案具体在野生型BSH酶(SEQ ID NO:5)的80位甘氨酸上进行了单氨基酸的突变，突变为丙氨酸。氨基酸突变后获得的酶，其热稳定性得到了很大的提升。专利技术人分析突变后的酶的热稳定性提升的原因在于，丙氨酸相对于甘氨酸为非极性更强的氨基酸，酶分子表面的疏水性发生改变，酶的三维结构发生微调，进而使胆盐水解酶的热稳定性得到了提升。本方案获得的胆盐水解酶，改善了野生型胆盐水解酶热稳定性低以及不利于大规模生产的缺陷。本在胆盐水解酶中，影响酶学性质的位点为野生型BSH的第2位氨基酸(半胱氨酸)。本方案将非酶活中心的甘氨酸变成丙氨酸，通常来说，非酶活中心的氨基酸发生突变对酶的功能的影响不会太大，但是本方案的突变形式却大大地改善了酶的热稳定性，提高了近六十个百分点，获得了预料不到的技术效果。
[0008]虽然现有技术中有通过基因突变实现热稳定性改变的操作，但是针对于本方案的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的胆盐水解酶(来源于长双歧杆菌Bifidobacterium longum)尚无有关于基因突变操作的报道。因为没有相关现有技术的参考，给酶的基因工程改造以及关键突变位点的选择带来了极大的困难。专利技术人通过大量研究筛选，针对于本方
案的胆盐水解酶在第80位的甘氨酸上进行突变，且突变成为丙氨酸，可获得非常理想的增加酶的热稳定性的效果。对其他位点的突变，或者将第80位的甘氨酸突变成其他氨基酸，均不能获得较为理想的增强热稳定性的效果。
[0009]进一步，一种热稳定性增强的胆盐水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。序列如SEQ ID NO:4的基因经过密码子改造，适合在大肠杆菌系统中复制以及表达。
[0010]进一步，一种热稳定性增强的胆盐水解酶的制备方法，包括以下依次进行的步骤：
[0011]S1：将核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的胆盐水解酶基因整合到空质粒上，获得表达载体；
[0012]S2：使用表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，获得工程菌；
[0013]S3：诱导所述工程菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的蛋白，获得酶菌体；
[0014]S4：破碎酶菌体并取经离心后产生的上清液，所述上清液再经纯化处理，获得胆盐水解酶。
[0015]采用上述技术方案，通过基因突变的手段获得核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的基因；再将基因整合在表达载体上，制备含有表达载体的工程菌；诱导工程菌表达目的蛋白，经纯化分离后即可获得高纯度的目的蛋白。
[0016]进一步，在S1中，通过重叠PCR获得核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的基因。
[0017]采用上述技术方案，通过重叠PCR可制备获得含有标的突变的基因，重叠PCR技术成熟且易于操作。本方案对野生型胆盐水解酶的基因密码子进行优化和定点突变，适宜于在大肠杆菌中表达。
[0018]进一步，所述重叠PCR的引物组合包括：序列如SEQ ID NO:11所示的引物、序列如SEQ ID NO:12所示的引物、序列如SEQ ID NO:15所示的引物和序列如SEQ ID NO:16所示的引物。使用上述引物组合可以合成具有标的突变的核苷酸片段。
[0019]进一步，在S2中，所述空质粒含有GST标签。GST亲和标签有助于提升大肠杆菌中表达的酶蛋白的可溶性。现有技术中，在大肠杆菌中表达选取的是pET系列的载体，His亲和标签，表达量低，可溶性差，多为包涵体。更换标签之后，在蛋白前段加上了GST亲和标签，提高了酶蛋白的可溶性，也有助于蛋白的正确折叠，从而提高酶的产量和活性。
[0020]进一步，在S3中，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21 DE3感受态细胞。BL21(DE3)感受态细胞为现有技术中用于表达目的蛋白的常规菌种，易于获取和实现产业化。
[0021]进一步，在S4中，使用IPTG诱导所述工程菌表达蛋白。IPTG诱导为现有技术中工程菌表达目的蛋白的常规诱导方式，技术成熟可靠，易于操作。
[0022]进一步，在S5中，使用超声法破碎酶菌体；使用GST亲和柱纯化所述上清液。由于空质粒上含有GST标签，可以利用GST标签来对表达出的酶进行亲和纯化。
[0023]进一步，一种热稳定性增强的胆盐水解酶在制备药品、保健品或者化妆品上的应用。
[0024]采用上述技术方案，本方案提供的胆盐水解酶在大肠杆菌工程菌中的表达量高，表达出的酶可溶性好，并且通过基因突变的方式可提升胆盐水解酶的热稳定性，以利于工业化放大生产。本方案获得的胆盐水解酶可以应用在药品、保健品、食品或者化妆品的制备上，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0025]图1为本专利技术的实施例2的BSH(G80I)酶在BL21(DE3)中的诱导表达后的SDS
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[0026]图2为本专利技术的实施例2的BSH(G80A)酶在BL21(DE3)中的诱导表达后的SDS
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[0027]图3为本专利技术的实施例2的BSH(G80I)酶的可溶性检测结果图。
[0028]图4为本专利技术的实施例2的BSH(G80A)酶的可溶性检测结果图。
[0029]图5为本专利技术的实施例3的BSH(G80I)酶纯品(GST标签除去本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性增强的胆盐水解酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.根据权利要求1所述的一种热稳定性增强的胆盐水解酶，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。3.一种热稳定性增强的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：S1：将核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的胆盐水解酶基因整合到空质粒上，获得表达载体；S2：使用表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，获得工程菌；S3：诱导所述工程菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的蛋白，获得酶菌体；S4：破碎酶菌体并取经离心后产生的上清液，所述上清液再经纯化处理，获得胆盐水解酶。4.根据权利要求3所述的一种热稳定性增强的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：在S1中，通过重叠PCR获得核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的胆盐水解酶基因。5.根据权利要求4所述的一种热稳定性增强的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴齐龙，唐宗兴，何兆海，胡德祥，
申请(专利权)人：重庆极泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：