一种具有分泌N-酰基高丝氨酸内酯酰化酶的重组工程菌的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种PvdQ重组工程菌的制备方法，PvdQ重组工程菌能够分泌N

【技术实现步骤摘要】
一种具有分泌N
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酰基高丝氨酸内酯酰化酶的重组工程菌的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及工程菌的基因改造领域，尤其涉及一种N
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酰基高丝氨酸内酯酰化酶PvdQ重组工程菌的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]生物膜代表一种具有高度组织水平的生物系统，其中的微生物形成结构化、协调性和功能性的群落，使大多数微生物病原体对常用的抗生素和消毒剂具有抗性。众所周知，抗生素过度使用会对微生物带来选择压力，造成微生物耐药性的发展。在大多数情况下，生物膜使微生物引发的疾病状况恶化，据研究，生物膜状态细菌对抗生素的抗性是浮游状态的1000倍。可见，细菌疾病的感染以及耐药性的发展与生物膜形成问题密切相关，因此，需要新的抗生素替代策略控制生物膜污染。
[0003]为了形成生物膜这一协调合作的群体行为，细菌共享基于种群密度的细胞间信号传导机制，称为群体感应(QS)。QS作为微生物的细胞间通讯系统，通过统称为自诱导剂的信号分子来调节和监测种群密度的变化，这些信号分子在环境中局部积累，然后在达到适当的阈值浓度后，与受体蛋白相互作用并触发QS相关基因和性状的表达，包括酰基高丝氨酸内酯(Acyl Homoserine Lactone，AHL)、自诱导肽(AIP)或自诱导肽2(AI
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2)，其中AHL信号分子介导的QS系统主要调控革兰氏阴性细菌性状。
[0004]因此，任何可以干扰或抑制细菌QS系统正常运转的方法都有可能被用作抗生素替代策略。QS抑制又被称为群体淬灭(Quorum Quenching,QQ)，通常包括抑制QS信号的产生、传递和识别，或使用酶降解QS信号。例如，一些被称为“群体淬灭菌”的细菌产生的酶降解AHL信号是实现QS抑制的最有效的策略之一。关于AHL的降解有两种不同的酶促机制：AHL
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内酯酶裂解内酯环和AHL
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酰化酶裂解酰胺键。AHL
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酰化酶的反应产物可以被微生物用作碳和氮源，并且不能自发地形成功能性QS信号。此外，QQ酶本身不会杀死细菌，而是以QQ的方式抑制病原菌毒力因子的分泌，避免了细菌耐药性的产生。研究表明，一些细菌产生具有降解AHL能力的酶可用于控制和治疗人类以及农业和水产养殖中的细菌生物膜污染，包括aiiA内酯酶、AIIO
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AIO6酰化酶。然而，对重组PvdQ酰化酶的QQ活性以及重组PvdQ工程菌在细菌生物膜污染方面的应用潜力了解较少。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的在于提供一种N
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酰基高丝氨酸内酯酰化酶PvdQ重组工程菌的制备方法及其对生物膜抑制活性的检测，该制备方法能够重组PvdQ降解酶基因，重组后的PvdQ工程菌对铜绿假单胞菌和膜生物反应器中污泥细菌的生物膜的生长具有显著抑制作用。
[0006]为达到以上目的，本专利技术采用的技术方案为：一种PvdQ重组工程菌的制备方法，PvdQ重组工程菌能够分泌N
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酰基高丝氨酸内酯酰化酶，具体包括如下步骤：
[0007]S1：构建包含PvdQ基因的重组表达载体pET
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PvdQ；
[0008]S2：将重组表达载体pET
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PvdQ转化大肠埃希氏菌BL21中得到PvdQ重组工程菌；
[0009]优选地，步骤S1具体又包括如下步骤：
[0010]S11：将铜绿假单胞菌接菌至LB培养基中，30℃培养12h；
[0011]S12：提取铜绿假单胞菌的基因组作为目的基因扩增模板，对重组前的PvdQ进行PCR扩增；
[0012]S13：对PCR扩增产物进行回收、纯化；
[0013]S14：用限制性内切酶BamH I、Hind III分别双酶切纯化后的PCR扩增产物和载体pET
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28a(+)；
[0014]S15：将双酶切产物和载体骨架连接，得到重组表达载体pET
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PvdQ。
[0015]优选地，PCR引物序列如下，下划线代表酶切位点：
[0016]PvdQ
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F:GCGGATCCATGGGGATGCGTACCGTACTGAC；
[0017]PvdQ
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R:GCAAGCTTGTTCGCGAATGCTTAGCCGTTGCA。
[0018]优选地，步骤S2具体包括如下步骤：
[0019]S21：取大肠杆菌感受态细胞冰上溶解，将所述重组表达载体pET
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PvdQ加入大肠杆菌感受态细胞中混匀，冰上静置一段时间，然后42℃水浴一段时间，再冰上静置一段时间，然后加入无菌SOC培养基于一定温度的培养箱中振荡活化一段时间；
[0020]S22：取适量活化后的重组菌液涂布于含有X
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Gal、Kan和IPTG的固体LB培养基中培养，挑取阳性单克隆工程菌进行测序，测序正确的工程菌即为PvdQ重组工程菌。
[0021]本专利技术还提供了一种PvdQ重组工程菌，采用上述制备方法制备。
[0022]本专利技术还提供了一种N
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酰基高丝氨酸内酯酰化酶的制备方法，具体包括如下步骤：
[0023]S3：将PvdQ重组工程菌接种到培养基中培养，所述PvdQ重组工程菌采用上述制备方法进行制备。
[0024]优选地，所述步骤S3具体包括如下步骤：
[0025]S31：将PvdQ重组工程菌接种于IPTG诱导LB培养基增殖液体中培养；
[0026]S32：通过离心超声破碎获得重组蛋白PvdQ，即得到含N
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酰基高丝氨酸内酯酰化酶的粗蛋白。
[0027]优选地，所述制备方法还包括步骤S4，对粗蛋白进行纯化，具体包括如下步骤：S41：在Mag
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Beads His
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Tag蛋白纯化磁珠中加入一定体积的Washing buffer，并洗涤磁珠至少三遍，弃去上清液；
[0028]S42：加入适量PvdQ酰化酶与Mag
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Beads His
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Tag蛋白纯化磁珠室温结合一段时间，再用Washing buffer洗涤三次并弃去上清液；
[0029]S43：向步骤S42得到的产物加入一定量的Elution buffer并收集上清液，即获得纯化后的PvdQ酰化酶。
[0030]本专利技术提供了一种N
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酰基高丝氨酸内酯酰化酶，采用上述制备方法制备。
[0031]本专利技术提供了一种PvdQ重组工程菌在抑制致病菌生物膜中的应用，其特征在于，所述PvdQ重组工程菌采用上述制备方法制备。
[0032]本专利技术提供了一种N
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酰基高丝氨酸内酯酰化酶在抑制致病菌生物膜中的应用，其
特征在于，所述N
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酰基高丝氨酸内酯酰化酶采用上述N
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酰基高丝氨酸内酯酰化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PvdQ重组工程菌的制备方法，PvdQ重组工程菌能够分泌N
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酰基高丝氨酸内酯酰化酶，具体包括如下步骤：S1：构建包含PvdQ基因的重组表达载体pET
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PvdQ；S2：将重组表达载体pET
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PvdQ转化到大肠埃希氏菌BL21中，得到PvdQ重组工程菌。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1具体又包括如下步骤：S11：将铜绿假单胞菌接菌至LB培养基中，30 ℃培养12h；S12：提取铜绿假单胞菌的基因组作为目的基因扩增模板，对重组前的PvdQ进行PCR扩增；S13：对PCR扩增产物进行回收、纯化；S14：用限制性内切酶BamH I、Hind III分别双酶切纯化后的PCR扩增产物和载体pET
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28a ( + )；S15：将双酶切产物和载体骨架连接，得到重组表达载体pET
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PvdQ。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，PCR引物序列如下，下划线代表酶切位点：PvdQ
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F:GCGGATCCATGGGGATGCGTACCGTACTGAC；PvdQ
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R:GCAAGCTTGTTCGCGAATGCTTAGCCGTTGCA。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2具体包括如下步骤：S21：取大肠杆菌感受态细胞冰上溶解，将所述重组表达载体pET
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PvdQ加入大肠杆菌感受态细胞中混匀，冰上静置一段时间，然后42℃水浴一段时间，再冰上静置一段时间，然后加入无菌SOC培养基于一定温度的培养箱中振荡活化一段时间；S22：取适量活化后的重组菌液涂布于含有X
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Gal、Kan和 IPTG的固体LB培养基中培养，挑取阳性单克隆工程菌进行测序，测序正确的工程菌即为PvdQ重组工程菌。5.一种N<...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志斐，李军霖，谢骏，龚望宝，王广军，张凯，夏耘，郁二蒙，李红燕，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：