热稳定性提高的D-氨甲酰水解酶突变体及其在D-氨基酸合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种热稳定性提高的D

【技术实现步骤摘要】
热稳定性提高的D
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氨甲酰水解酶突变体及其在D
‑
氨基酸合成中的应用


[0001]本专利技术涉及一种热稳定性提高的D
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氨甲酰水解酶突变体及其在D
‑
氨基酸合成中的应用，属于酶工程


技术介绍

[0002]D
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氨基酸是一种重要的非天然氨基酸，广泛分布在微生物、植物和动物中。D
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氨基酸可以合成各种抗生素类药物，而其中的一些药物如阿莫西林、氨苄青霉素、青霉素等被世界卫生组织定义为必须药物。不仅如此，D
‑
氨基酸在食品、农业及化工行业都有着广泛的作用。
[0003]可用于合成光学纯D
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氨基酸的生物催化剂主要有三类，分别为水解酶、氧化还原酶和D
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氨基酸转氨酶。其中水解酶是制备D
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氨基酸较为广泛的一类酶，它们通常以外消旋化合物作为底物，通过拆分理论上可以达到50％的得率，结合消旋酶可以实现100％的理论得率，具有底物范围广，产物得率高，副产物少等优点。目前报道的用于合成D
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氨基酸的水解酶主要包括D
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海因酶和D
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氨甲酰水解酶偶联的海因酶过程、N
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酰基
‑
D
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氨基酸酰胺水解酶、D
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氨基酸酰胺酶、D
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氨基肽酶和D
‑
肽酶。
[0004]D
‑
氨甲酰水解酶(D
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carbamoylase，HyuC)是属于腈水解酶超家族的第6类(EC 3.5.1.77)，它可以将N
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氨甲酰
‑
D
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氨基酸水解得到D
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氨基酸，常被用来与海因消旋酶和海因酶构成级联反应制备光学纯D
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氨基酸。然而已鉴定的野生型酶及其突变体的热稳定性普遍较低。为满足工业化应用的需求，不同属性的D
‑
氨甲酰水解酶的定向挖掘与热稳定性分析，以及基于定向进化和理性设计的D
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氨甲酰水解酶热稳定性分子改造等研究已被广泛开展。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种热稳定性提高的D
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氨甲酰水解酶突变体，在专利技术人前期研究的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D
‑
氨甲酰水解酶的基础上进行了适当的突变，从而获得了热稳定性提高的突变体，使其能在食品和医药领域中有广泛应用。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种热稳定性提高的D
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氨甲酰水解酶突变体，所述D
‑
氨甲酰水解酶突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D
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氨甲酰水解酶为亲本，分别将其第138、202、204、208、277及284位的氨基酸进行突变。
[0007]进一步地，所述D
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氨甲酰水解酶突变体为将亲本的第138位点的谷氨酸Glu突变为色氨酸Trp或丝氨酸Ser；或，
[0008]将亲本的第202位点的丝氨酸Ser突变为脯氨酸Pro；或，
[0009]将亲本的第204位点的丝氨酸突变为天冬氨酸Asp或天冬酰胺Asn；或，
[0010]将亲本的第208位点的谷氨酸Glu突变为天冬氨酸Asp；或，
[0011]将亲本的第277位点的精氨酸Arg突变为亮Leu、谷氨酰胺Gln或谷氨酸Glu；或，
[0012]将亲本的第284位点的组氨酸His突变为苏氨酸Thr或天冬酰胺Asn。
[0013]进一步地，所述D
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氨甲酰水解酶突变体为将亲本的第202位点的丝氨酸Ser突变为脯氨酸Pro，并将第208位的谷氨酸Glu突变为天冬氨酸Asp，并将第277位的精氨酸Arg突变为亮Leu。
[0014]本专利技术的第二个目的是提供一种所述D
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氨甲酰水解酶突变体的编码基因。
[0015]本专利技术的第三个目的是提供一种携带所述编码基因的表达载体。
[0016]本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述D
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氨甲酰水解酶突变体的基因工程菌。
[0017]进一步地，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。
[0018]进一步地，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
[0019]进一步地，所述基因工程菌是以pET
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28a(+)为表达载体。
[0020]本专利技术的第五个目的是提供所述D
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氨甲酰水解酶突变体或所述基因工程菌在制备D
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氨基酸中的应用。
[0021]进一步地，所述应用是以N
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氨甲酰
‑
D
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氨基酸为底物，以所述D
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氨甲酰水解酶突变体或所述基因工程菌为催化剂，催化生成D
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氨基酸。
[0022]进一步地，所述催化的条件是38～42℃，150～250rpm。
[0023]本专利技术的有益效果是：
[0024]本专利技术在来源于Nitratireductor indicus的D
‑
氨甲酰水解酶(NiHyuC
‑
M4)的基础上通过定点突变获得了热稳定性不同程度提高的突变体。其中，单突变体E138W、E138S、S202P、S204D、S204N、E208D、R277L、R277Q、R277E、H284T、H284N在40℃的t
1/2
值由M4的1.3h分别增加到2.2h、1.7h、2.3h、1.9h、1.7h、3.3h、8.0h、2.3h、1.6h、2.2h、1.8h。经过组合突变获得的最佳突变体S202P/E208D/R277L在40℃的t
1/2
值为M4的28.5倍，约为36.5h。具有与M4(288min
‑1·
mM
‑1)相当的催化效率，为302min
‑1·
mM
‑1。M4在40℃下催化100mM N
‑
氨甲酰
‑
D
‑
色氨酸反应24h时转化率仅为60.8％，而S202P/E208D/R277L则可以在24h时完成99.4％的转化。这表明突变体S202P/E208D/R277L能够在较高温度下进行反应，具有良好的工业应用前景。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0026]下述实施例中涉及的培养基如下：
[0027]LB液体培养基：蛋白胨10g
·
L
‑1，酵母浸膏5g
·本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的D
‑
氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所述D
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氨甲酰水解酶突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D
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氨甲酰水解酶为亲本，分别将其第138、202、204、208、277及284位的氨基酸进行突变。2.根据权利要求1所述的D
‑
氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所述D
‑
氨甲酰水解酶突变体为将亲本的第138位点的谷氨酸Glu突变为色氨酸Trp或丝氨酸Ser；或，将亲本的第202位点的丝氨酸Ser突变为脯氨酸Pro；或，将亲本的第204位点的丝氨酸突变为天冬氨酸Asp或天冬酰胺Asn；或，将亲本的第208位点的谷氨酸Glu突变为天冬氨酸Asp；或，将亲本的第277位点的精氨酸Arg突变为亮Leu、谷氨酰胺Gln或谷氨酸Glu；或，将亲本的第284位点的组氨酸His突变为苏氨酸Thr或天冬酰胺Asn。3.根据权利要求1所述的D
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氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所述D
‑
氨甲酰水解酶突变体为将亲本的...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪晔，胡佳敏，许国超，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：