一种催化活性提高的蛋白质谷氨酰胺酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种催化活性提高的蛋白质谷氨酰胺酶突变体及其应用。本发明专利技术通过对解朊金黄杆菌来源的蛋白质谷氨酰胺酶进行分子改造，经过定点突变或饱和突变，筛选获得活性提高的蛋白质谷氨酰胺酶突变体，PG突变体Ala291Ser比酶活较初始PG提高了17.02％，催化效率(K

【技术实现步骤摘要】
一种催化活性提高的蛋白质谷氨酰胺酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种催化活性提高的蛋白质谷氨酰胺酶突变体及其应用，属于酶工程


技术介绍

[0002]蛋白质谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.44，protein glutaminase，简称PG)是近年来广泛关注的脱酰胺酶，属于酰胺基水解酶类。PG可以水解大分子蛋白质和一些小肽侧链的谷氨酰胺并生成L
‑
谷氨酸和氨，从而改善蛋白质的各项功能性质，降低植物蛋白酶的致敏性，在食品、生物医药以及化妆品等行业具有广泛应用。目前PG的主要用途是改善植物蛋白的功能性质。例如，PG能使米谷蛋白的溶解度和凝胶性等功能性质提高，还可有效提高大豆分离蛋白的溶解度、乳化性和起泡性等。在食品行业中，PG对于改善米谷蛋白、大豆蛋白、小麦面筋蛋白等植物蛋白的功能性质具有显著效果。相对于其他脱酰胺酶，PG发挥作用时不需要满足特定的条件，不会产生不良风味且作用范围广。PG脱酰胺时反应条件温和，专一性强，效率高且副反应少，因此通过PG的脱酰胺作用可以扩展植物蛋白在食品行业中更广泛的应用，成为植物蛋白脱酰胺的首选。
[0003]目前，研究PG过程中仍然存在野生菌株酶表达量低、重组菌株活性表达低等问题，不适合用于许多工业应用。为了实现蛋白质谷氨酰胺酶在工业上的低成本应用，高活性是至关重要的。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术基于半理性设计的分子改造有效提高了蛋白质谷氨酰胺酶的催化活性，有望实现重组表达的蛋白质谷氨酰胺酶在工业中的广泛应用。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种催化活性提高的蛋白质谷氨酰胺酶突变体，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质谷氨酰胺酶为亲本，将亲本第291位氨基酸残基进行突变得到。
[0006]进一步地，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质谷氨酰胺酶的第291位丙氨酸突变为丝氨酸。
[0007]进一步地，蛋白质谷氨酰胺酶亲本的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供一种编码所述的蛋白质谷氨酰胺酶突变体的基因。
[0009]进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]本专利技术的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组质粒。
[0011]进一步地，所述重组质粒的表达载体包括pP43系列载体。
[0012]本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述蛋白质谷氨酰胺酶突变体的重组细胞。
[0013]进一步地，所述重组细胞以枯草芽孢杆菌为宿主。
[0014]本专利技术的第五个目的是提供所述蛋白质谷氨酰胺酶突变体、所述基因、所述重组质粒或所述重组细胞在食品中的应用。
[0015]本专利技术的第六个目的是提供所述蛋白质谷氨酰胺酶突变体的构建方法，包含如下步骤：
[0016](1)基于计算机辅助合理设计，使用定点突变引物通过全质粒扩增获得目标突变体；
[0017](2)使用简并引物通过全质粒PCR对候选氨基酸位点进行饱和诱变。
[0018]本专利技术的第七个目的是提供一种生产所述蛋白质谷氨酰胺酶突变体的方法，包括以下步骤：
[0019](1)将所述重组细胞的单菌落接种至LB液体培养基中，于温度37℃、220rpm的条件下培养8～10h，得到种子液；
[0020](2)将种子液以2～5％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基中，于温度37℃、220rpm的条件下培养10～15h，得到重组细胞的培养液；
[0021](3)将培养液离心取上清得到粗酶液；
[0022](4)将粗酶液进行镍柱亲和层析，得到蛋白质谷氨酰胺酶的纯酶液。
[0023]本专利技术的有益效果是：
[0024]本专利技术通过对解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)来源的蛋白质谷氨酰胺酶进行分子改造，分别对其153、154、193、291和292位进行突变并筛选，最终获得催化活性提高的蛋白质谷氨酰胺酶突变体。与初始PG相比，本专利技术提供的蛋白质谷氨酰胺酶突变体的比活性提高了17.02％，改善了蛋白质谷氨酰胺酶活性低的问题，为其工业化应用奠定了基础。
附图说明：
[0025]图1为基于半理性设计的突变体文库筛选结果分析图，其中A为蛋白质谷氨酰胺酶153位点的突变体发酵酶活；B为154位点的突变体发酵酶活；C为193位点的突变体发酵酶活；D为291位点的突变体发酵酶活；E为292位点的突变体发酵酶活。
[0026]图2为初始PG及突变体A291S的最适反应温度和最适pH，其中A为初始PG及突变体A291S的最适反应温度；B为初始PG及突变体A291S的最适反应pH。
[0027]图3为初始PG及突变体A291S的反应动力学参数，其中A为采用双倒数作图法和非线性回归拟合的初始PG催化不同浓度底物而生成氨的速率；B为采用双倒数作图法和非线性回归拟合的突变体A291S催化不同浓度底物而生成氨的速率。
具体实施方式
[0028]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0029]LB/种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。
[0030]TB/发酵培养基(g/L)：酵母粉24、胰蛋白胨12、甘油5、K2HPO
4 12.54、KH2PO
4 2.31。
[0031]一个单位的PG活性(U)定义为：单位体积发酵酶液在37℃，每分钟水解二肽Cbz
‑
Gln
‑
Gly释放1μmol氨为1个酶活力单位(U
·
mL
‑1)。
[0032]蛋白质谷氨酰胺酶酶活测定方法：取发酵液于4℃、10000rpm离心5min，取上清稀释适当倍数，将稀释后的部分发酵液于100℃煮沸5min作为对照组。取1mL二肽Cbz
‑
Gln
‑
Gly
溶液于37℃水浴锅温浴10min，加入100μL稀释过的发酵上清(以高温处理过的发酵上清为对照)混匀后置于37℃水浴锅中反应30min，反应结束后加入1mL 0.4mol
·
L
‑1三氯乙酸溶液，混匀并终止反应。取60μL反应液与240μL蒸馏水、300μL显色试剂A、150μL显色试剂B和300μL显色试剂C充分混匀，置于37℃水浴锅中孵育20min，冷却，测量体系在630nm处的光吸收值。
[0033]蛋白分离纯化：利用镍柱亲和层析的方法对PG蛋白进行分离纯化，具体过程如下：将发酵液进行4℃，12000rpm离心30min，将发酵上清过0.22μm微孔滤膜；打开沉降柱上封口，将沉降柱中的20％乙醇保存液倒出，放在支架上，加入15mL左右的ddH2O，并打开下封口，使其自然沉降本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种催化活性提高的蛋白质谷氨酰胺酶突变体，其特征在于，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质谷氨酰胺酶为亲本，将亲本第291位氨基酸残基进行突变得到。2.根据权利要求1所述的蛋白质谷氨酰胺酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质谷氨酰胺酶的第291位丙氨酸突变为丝氨酸。3.根据权利要求1所述的蛋白质谷氨酰胺酶突变体，其特征在于，蛋白质谷氨酰胺酶亲本的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种编码权利要求1～3任一项所述的蛋白质谷氨酰胺酶突变体的基因。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国强，陈坚，堵国成，李江华，周景文，马舒婕，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：