一种提高蛋白质谷氨酰胺酶生产酶活的方法技术

本发明专利技术提供了提高蛋白质谷氨酰胺酶（PG）生产酶活的方法。该方法包括种子培养基配方：含鱼粉蛋白胨1.5%~2%，酵母浸膏1.5~2%，氯化钠0.5~1%，葡萄糖0.2~0.3%；发酵培养基配方：鱼粉蛋白胨1.5~2.5%，酵母浸膏0.5

【技术实现步骤摘要】
N, Uhl
é
n M, et al. Optimization of electroporation
‑
mediated transformation: Staphylococcus carnosus as model organism[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 102(3): 736
‑
747. ）。同时，吐温
‑
80也可以增加细胞流动性，本专利技术首次创新性地将甘氨酸结合吐温
‑
80应用在发酵后期过程中，从而影响PG的分泌效率，提高PG的生产水平。
附图简述
[0016]附图1为实施例1发酵过程中的酶活曲线。
实施方式
[0017]以下实施例所用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
[0018]试剂CAS号购自鱼粉蛋白胨91079
‑
42
‑
4斯泰博上海生物科技有限公司酵母浸膏8013
‑
01
‑
2斯泰博上海生物科技有限公司氯化钠7647
‑
14
‑
5上海国药集团化学试剂有限公司葡萄糖14431
‑
43
‑
7上海国药集团化学试剂有限公司乳糖63
‑
42
‑
3上海国药集团化学试剂有限公司碳酸钠497
‑
19
‑
8上海国药集团化学试剂有限公司硫酸铁15244
‑
10
‑
7上海国药集团化学试剂有限公司氯化镁7791
‑
18
‑
6上海国药集团化学试剂有限公司食品级吐温
‑
809005
‑
65
‑
6斯泰博上海生物科技有限公司甘氨酸56
‑
40
‑
6上海国药集团化学试剂有限公司CBZ
‑
Gln
‑
Gly6610
‑
42
‑
0Sigma
‑
Aldrich下面结合实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。显然，所描述的实施例是用于说明本专利技术的一部分实施例，而不应视为限制本专利技术的范围。
实施例
[0019]一种能够提高解朊金黄杆菌来源的PG产量的方法，包括如下步骤：步骤一、准备种子挑取经活化稳定培养的解朊金黄杆菌单菌落，接种到种子培养基中，种子培养基组分如下：鱼粉蛋白胨1.5%，酵母浸膏1.5%，氯化钠1%，葡萄糖0.2%，pH调整为6.8。置于恒温摇床中，30℃，220 rpm过夜培养。
[0020]步骤二、接种将上述过夜培养的种子液，接种到装有发酵培养基的3 L发酵罐中，接种量为2%。发酵培养基组分如下：鱼粉蛋白胨2%，酵母浸膏0.5%，碳酸钠0.1%，氯化镁0.004%，硫酸铁0.0005%，乳糖0.2%，pH调整为6.8。
[0021]步骤三、发酵控制设置发酵温度为33℃，搅拌桨转速为700 rpm，发酵初始通气量控制在0.5 vvm，待培养6 h后，调整通气量为2.0 vvm。设置恒速补料，在前36 h内，添加葡萄糖总量为3%。在发
酵第36 h，停止补充葡萄糖，添加甘氨酸终浓度为0.1%，同时添加食品级吐温
‑
80至终浓度为0.01%。发酵进行60 h停止，过程中每隔12 h或6 h取一次样，检测PG的酶活。
[0022]酶活测定参照Yamaguchi S等（Yamaguchi S, Yokoe M. A novel protein
‑
deamidating enzyme from Chryseobacterium proteolyticum sp. nov., a newly isolated bacterium from soil[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(8): 3337
‑
3343.）的方法，并作部分调整：（1）配制显色剂 1： 7.5 mg 亚硝基铁氰化钠和2.023 g 苯酚，溶于双蒸水并定容至50 mL；显色剂 2：2.5 g 氢氧化钾溶于双蒸水并定容至50 mL；显色剂3： 10.2 g 无水碳酸钾溶于双蒸水，滴加417 μL次氯酸钠溶液，加水定容至50 mL。
[0023]（2）取发酵结束的发酵液1 mL，12000 r/min，4℃离心5 min，取上清稀释相应倍数，以备检测其中PG的酶活力。
[0024]（3）将部分上清稀释液置于95℃水浴锅处理5 min 作为对照组。取1 mL 二肽Cbz
‑
Gln
‑
Gly 溶液于37℃水浴锅预热10 min，加入100 μL上清稀释液混匀，然后置于37℃水浴锅反应30 min，然后迅速加入1 mL 0.4 M 三氯乙酸溶液终止反应。
[0025]（4）采用苯酚法测定反应后溶液中氨的含量。取60 μL 反应液与240 μL 蒸馏水、300 μL 显色剂1、150 μL 显色剂2 和300 μL 显色剂3，充分混匀，置于37℃水浴锅中孵育20 min，冷却，测量体系在630 nm处的光吸收值（氨的浓度标准曲线根据同样的方法进行测定）。根据氨的量计算上清液中酶的活力，定义每分钟水解Cbz
‑
Gln
‑
Gly产生1μmol氨所需的酶的量为一个酶活单位。
[0026]如附图1所示，根据上述方法测定发酵液上清的酶活，最高出现在48h，为18. 69 U/mL。比现有报道的解朊金黄杆菌的生产酶活（5.43 U/mL）提高了244%。
[0027]上述仅为本专利技术的部分优选实施例，本专利技术并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本专利技术技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本专利技术保护范围之内。
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高蛋白质谷氨酰胺酶生产酶活的方法。其特征在于：提供了种子培养基配方，发酵培养基配方以及相应的发酵培养工艺。2.根据权利要求1所述种子培养基，其特征在于：含鱼粉蛋白胨1.5%~2%，酵母浸膏1.5~2%，氯化钠0.5~1%，葡萄糖0.2~0.3%，pH调整为6.8左右。3.如权利要求1所述发酵培养基，其特征在于：鱼粉蛋白胨1.5~2.5%，酵母浸膏0.5
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：纪明华，连战胜，刘连碧，
申请(专利权)人：上海青瑞食品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：