一种几丁质脱乙酰酶、制备方法及其在几丁质水解中的应用技术

本发明专利技术提供了一种几丁质脱乙酰酶RsCDA、制备方法及其在几丁质水解中的应用。几丁质脱乙酰酶RsCDA来源于匍枝根霉，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术还公开了该几丁质脱乙酰酶RsCDA与来源于哈维氏弧菌的几丁质酶VhChit2在几丁质水解中具有协同作用，当协同水解温度为40～70℃，pH 6～8，RsCDA与VhChit2的摩尔浓度比为1：1～10：1，水解时间为0～5h，产生的乙酸含量是RsCDA水解的175.6％，还原糖含量是VhChit2水解的120.3％，协同水解后的几丁质脱乙酰度是RsCDA水解后的128.4％。该几丁质脱乙酰酶RsCDA与几丁质酶VhChit2的协同可以有效提高对几丁质的水解程度，在几丁质的生物转化中具有较好的应用价值。有较好的应用价值。有较好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种几丁质脱乙酰酶、制备方法及其在几丁质水解中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种几丁质脱乙酰酶RsCDA、制备方法及其在几丁质水解中的应用，

技术介绍

[0002]几丁质是自然界中除纤维素外第二多的多糖化合物，是一种重要的可再生资源，广泛存在于真菌、甲壳类动物、海洋藻类和昆虫中。几丁质具有抗菌活性、去除重金属、伤口愈合等生物学特性，可广泛应用于食品、农业、环境和医疗中。
[0003]然而，几丁质高度的晶体结构，使其不溶于水、稀酸和稀碱中。这成为制约几丁质工业化应用的技术难点。与几丁质相比，壳聚糖具有更好的溶解性和生物活性，在食品保鲜、医药、化妆品、生物修复等方面有广泛的应用。而且，壳聚糖的生物活性很大程度上取决于其理化参数，如聚合度、脱乙酰度和脱乙酰模式。
[0004]利用浓碱将几丁质转化成壳聚糖会产生大量碱性废水，而且生成的壳聚糖表现出随机的脱乙酰模式。采用几丁质脱乙酰酶将几丁质中的部分乙酰基脱除生成的壳聚糖，具有脱乙酰位置一致的优点。目前，能直接作用于几丁质底物的几丁质脱乙酰酶较少，且酶的催化活性很低，这成为制约几丁质脱乙酰酶工业化制备壳聚糖的技术难题。挖掘较高活性的新型几丁质脱乙酰酶并促进几丁质的水解可为几丁质资源的有效开发和高质量壳聚糖的制备提供酶资源和技术支持。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的是针对现有的几丁质脱乙酰酶较少且酶活性很低的问题，提供一种新的几丁质脱乙酰酶RsCDA，其具有较高的活性，其与几丁质酶VhChit2协同水解几丁质。
[0006]为实现上述目的，采用以下技术方案：
[0007]提供一种来源于匍枝根霉(Rhizopus plagiostemon)的几丁质脱乙酰酶RsCDA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]编码所述的匍枝根霉几丁质脱乙酰酶RsCDA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术提供一种重组表达载体，其含有所述的几丁质脱乙酰酶RsCDA的基因序列。
[0010]本专利技术提供一种重组菌，其含有所述的重组表达载体。
[0011]本专利技术提供一种几丁质脱乙酰酶RsCDA的制备方法，包括如下步骤：
[0012](1)构建重组表达载体；
[0013](2)将所述重组表达载体转化至感受态细胞中；
[0014](3)对阳性细胞进行几丁质脱乙酰酶RsCDA的发酵诱导；
[0015](4)对几丁质脱乙酰酶RsCDA进行纯化。
[0016]进一步地，步骤(1)中所述的表达载体为质粒pPIC9K，将带有EcoRI和NotI酶切位点的几丁质脱乙酰酶RsCDA基因的DNA片段和质粒pPIC9K分别经EcoRI和NotI酶切后，按照
摩尔比10：1的比例进行连接。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选含有几丁质脱乙酰酶RsCDA基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证；
[0017]步骤(2)中所述的转化为将步骤(1)所述的重组表达载体通过内切酶BglII线性化后电转化法转入细胞；
[0018]所述的细胞为毕赤酵母GS115。
[0019]进一步地，步骤(3)中所述的发酵诱导为将重组菌毕赤酵母GS115接种至BMMY培养基中，发酵诱导几丁质脱乙酰酶RsCDA的表达；
[0020]所述的BMMY培养基的配方为：酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，硫酸铵10g，YNB 3.4g，磷酸钾缓冲液(1M，pH 6.0)100mL，甲醇10mL，蒸馏水定容至1000mL。
[0021]所述的诱导条件为：28℃，250rpm下培养，每24h添加0～2％甲醇进行诱导，诱导时间为3～7d。
[0022]步骤(4)中所述的纯化为采用镍亲和层析纯化重组蛋白。
[0023]进一步地，最适反应温度为40～70℃，最适pH为6～8。
[0024]本专利技术的另一目的在于提供所述的几丁质脱乙酰酶RsCDA在几丁质水解中的应用，具体为：
[0025]所述的几丁质来源于虾、蟹壳；
[0026]所述的几丁质的水解，为几丁质脱乙酰酶RsCDA和几丁质酶VhChit2对几丁质进行协同水解；
[0027]所述的协同水解几丁质的条件为：协同水解温度为40～70℃，pH 6～8，RsCDA与VhChit2的摩尔浓度比为1:1～10:1，水解时间为0～5h。
[0028]本专利技术具有以下的有益效果：
[0029](1)所述的几丁质脱乙酰酶RsCDA来源于匍枝根霉(Rhizopus plagiostemon)，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。经过PCR反应获得RsCDA基因序列，并添加酶切位点EcoRI和NotI，将该基因克隆至pPIC9K表达载体上，然后转化至毕赤酵母GS115宿主细胞中获得酵母重组菌。在该重组菌的发酵培养过程中添加0.5～2％甲醇进行诱导3～7d后，发酵上清液中的几丁质脱乙酰酶活力达到13.5U/mL，经镍亲和层析纯化后的比酶活力为5.2U/mg，是现有活性较高的几丁质脱乙酰酶。
[0030](2)本专利技术还阐明了RsCDA与来源于哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)几丁质酶VhChit2在几丁质水解中的协同作用。当它们协同水解温度为40～70℃，pH 6～8，RsCDA与VhChit2的摩尔浓度比为1：1～10：1，水解时间为0～5h，产生的乙酸含量是RsCDA水解的175.6％，还原糖含量是VhChit2水解的120.3％，协同水解后的几丁质脱乙酰度是RsCDA水解后的128.4％。本专利技术公开的几丁质脱乙酰酶RsCDA与几丁质酶VhChit2协同可以有效提高对几丁质的水解程度，在几丁质的生物转化中具有较好的应用价值。
[0031](3)本专利技术公开的几丁质脱乙酰酶RsCDA不仅可以水解胶体几丁质，还可以水解不溶性几丁质粉。
附图说明
[0032]图1：甲醇添加量对诱导过程中几丁质脱乙酰酶RsCDA活力的影响。
[0033]图2：重组几丁质脱乙酰酶RsCDA的SDS
‑
PAGE分析。其中，M表示标准蛋白分子量，1、
2、3表示发酵上清液，4、5、6表示纯酶液。
[0034]图3：重组几丁质脱乙酰酶RsCDA的酶学性质。
[0035]图4：RsCDA与VhChit2协同水解几丁质的条件优化。
[0036]图5：RsCDA与VhChit2协同水解几丁质后的脱乙酰度。
具体实施方式
[0037]通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038]本专利技术所述的匍枝根霉几丁质脱乙酰酶RsCDA由315个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于匍枝根霉的几丁质脱乙酰酶RsCDA，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.编码权利要求1所述的几丁质脱乙酰酶RsCDA，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。3.一种重组表达载体，其含有权利要求2所述的几丁质脱乙酰酶RsCDA的基因序列。4.一种重组菌，其含有权利要求3所述的重组表达载体。5.权利要求1所述的几丁质脱乙酰酶RsCDA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建重组表达载体；(2)将所述重组表达载体转化至感受态毕赤酵母细胞GS115中；(3)对阳性细胞进行几丁质脱乙酰酶RsCDA的发酵诱导；(4)对几丁质脱乙酰酶RsCDA进行纯化。6.如权利要求5所述的几丁质脱乙酰酶RsCDA的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的表达载体为质粒pPIC9K，将带有EcoRI和NotI酶切位点的几丁质脱乙酰酶RsCDA基因的DNA片段和质粒pPIC9K分别经EcoRI和NotI酶切后，按照摩尔比10：1的比例进行连接；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选含有几丁质脱乙酰酶RsCDA基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证；步骤(2)中所述的转化为将步骤(1)所述的重组表达载体通过内切酶BglII线性化后电转化...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永成，张巧，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：