G-7-ADCA合成酶及其在制备头孢烷酸类化合物中的应用制造技术

本发明专利技术通过计算机辅助设计获得一系列具有扩环活性的新型G

【技术实现步骤摘要】
G
‑7‑
ADCA合成酶及其在制备头孢烷酸类化合物中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及系列新的合成酶在合成G
‑7‑
ADCA中的应用。

技术介绍

[0002]头孢菌素是β
‑
内酰胺类抗生素的重要组成部分，具有耐药性高、对β
‑
内酰胺酶稳定、毒副作用小等优点，对多种细菌、病毒感染具有良好疗效，在临床领域得到广泛应用。7
‑
氨基
‑3‑
脱乙酰氧基头孢烷酸(7
‑
ADCA)是重要的头孢菌素类抗生素合成母核，可用于合成头孢羟氨、头孢拉定、头孢克罗等药物，而G
‑7‑
ADCA又是合成7
‑
ADCA的主要原料，市场需求量较大。
[0003]目前，以G
‑7‑
ADCA为中间体合成7
‑
ADCA主要有三种方法：化学酶法、发酵法和全酶法。化学酶法制备7
‑
ADCA以青霉素G(PenG)为原料，通过过氧乙酸将其氧化为青霉素G亚砜，然后扩环重排产生G
‑7‑
ADCA，最后在青霉素酰化酶的作用下脱去侧链生成7
‑
ADCA。此工艺在实际生产中存在众多不足：
①
氧化过程所用的氧化剂为40％的过氧乙酸，成本高、危险性大、产生危害环境的酸性废水；
②
扩环反应所用的酯化剂BSU严重过量，导致生产成本高；
③
产品7
>‑
ADCA质量不稳定，影响7
‑
ADCA的纯度及溶解度，从而影响产品的纯度。
[0004]在CN1075336A中公开，通过发酵法制备7
‑
ADCA，将来源于Streptomyces Clavuligerus菌株扩环酶(scDAOCS)基因导入到产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)中，在发酵培养基中添加己二酸，产黄青霉菌利用己二酸产生己二酰
‑6‑
APA，进一步通过产黄青霉菌扩环酶，将己二酰
‑6‑
APA环扩为己二酰
‑7‑
ADCA，然后利用己二酰酰基转移酶裂解己二酰侧链而获得终产物7
‑
ADCA。Alvarez等(Antimicrobial Agents&Chemotherapy,1987,31(11):1675
‑
82)发现在顶头孢霉菌中，以脱乙酰氧头孢菌素C(DAOC)为底物，在D型氨基酸氧化酶(DAO)催化下转化为酮己二酸
‑7‑
ADCA，同时产生过氧化氢，进一步通过过氧化氢的氧化生成戊二酰
‑7‑
ADCA(GL
‑7‑
ADCA)，最后在戊二酰酰化酶催化下生成7
‑
ADCA。由此可见，发酵法合成G
‑7‑
ADCA工艺步骤多并且存在发酵周期长等问题。
[0005]全酶法制备7
‑
ADCA，以PenG为底物在扩环酶作用下扩环合成G
‑7‑
ADCA，G
‑7‑
ADCA在青霉素酰化酶的催化下发生水解反应合成7
‑
ADCA，其合成路线如图1所示。该过程环保且工艺步骤简单，但扩环酶酶活较低，无法应用到工业生产中。因此，为了提高扩环酶的酶活性，进行了理性和非理性的改造。Hsu等(Applied and Environmental Microbiology,2004,70(10):6257
‑
6263)将8个不同菌属来源的基因进行DNA shuffling，获取FF8突变体，针对底物PenG的活性(k
cat
/K
M
)增加了117.8倍，但未测定对PenG的转化率。Ji等(Applied and Environmental Microbiology,2012,78(21):7809
‑
7812)在前人基础上，通过迭代组合突变，获得C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M/S261M、C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M/T213V/M73T以及C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M/T213V/S261M等组合突变体，活性提高了7
‑
8倍，是目前报道活性最高的突变体。CN1446908A中描述了一种扩环酶，在该专利文献中，提到了将155位半胱氨酸替换为酪氨酸、184位酪氨酸替换为组氨酸、275位缬氨酸替换为异亮氨酸、281位半胱氨酸替换为酪氨酸，通过改变以上一个或多个氨基酸而产生突变扩
环酶，并且酶活性有所提高，但酶活性提高依然有限，不能满足工业需求。
[0006]目前已经报道，还没有获得针对PenG高活性扩环酶，不能应用到工业生产中。因此，有必要在天然扩环酶序列基础上，设计新颖的G
‑7‑
ADCA合成酶，实现PenG到G
‑7‑
ADCA的高效生物转化。

技术实现思路

[0007]本专利技术通过计算机辅助设计获得一系列具有扩环活性的新型G
‑7‑
ADCA合成酶(突变体)，并通过实验验证，获得提高了对PenG催化活性的G
‑7‑
ADCA合成酶。
[0008]因而，本专利技术提供了SEQ ID No.2至SEQ ID No.21所示序列的G
‑7‑
ADCA合成酶，还提供了在SEQ ID No.11的基础上发生了C155Y/Y184H、V275I/C281Y/L305M、C155Y/Y184H/V275I/C281Y/L305M、C155Y/Y184H、V275I/C281Y/I305M、或C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M的突变的G
‑7‑
ADCA合成酶；
[0009]或者在SEQ ID No.19的基础上发生了C155Y/Y184H、V275I/C281Y/I305M、C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M的突变的G
‑7‑
ADCA合成酶。
[0010]进而本专利技术也提供编码上述G
‑7‑
ADCA合成酶的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。更优选地，所述核酸分子具体为编码上述G
‑7‑
ADCA合成酶的基因。
[0011]更进一步，本专利技术提供含上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0012]本专利技术还提供所述G
‑7‑
ADCA合成酶在催化PenG扩环生成G
‑7‑
ADCA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种G
‑7‑
ADCA合成酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 2至SEQ ID No. 21任一所示，或者在SEQ ID No.11的基础上发生了C155Y/Y184H、V275I/C281Y/L305M、C155Y/Y184H/V275I/C281Y/L305M、C155Y/Y184H、V275I/C281Y/I305M、或C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M的突变；或者在SEQ ID No.19的基础上发生了C155Y/Y184H、V275I/C281Y/I305M、C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M的突变。2.编码如权利要求1所述的G
‑7‑
ADCA合成酶的核酸分子；具体地，所述核酸分子是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；或者是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA；更优选地，所述核酸分子具体为编码上述G
‑7‑
ADCA合成酶的基因。3.含有如权利要求2所述的核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体；优选将转基因细胞系固定化得到固定化细胞。4.一种用于生产G
‑7‑
ADCA的固定化细胞，通过下述方式获得：将发酵的含有如权利要求2所述核酸分子的重组细胞进行收集离心，重悬菌体使其OD
600
为10到150，添加2
‑
8%的硅藻土，添加0.1
‑
2% w/v絮凝剂，添加0.07
‑
2% v/v交联剂，交联2
‑
3 h，获得固定化细胞。5.如权利要求1所述的G
‑7‑
ADCA合成酶在催化PenG扩环生成G
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ADCA中的应用。6.一种制备G
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ADCA的方法，具体包括如下步骤：将如权利要求1所述的G

【专利技术属性】
技术研发人员：孙周通，曲戈，苏文成，蒋迎迎，宋世怡，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：