一种褐藻胶裂解酶突变体制造技术

本发明专利技术属于分子生物学以及蛋白质工程领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶突变体

【技术实现步骤摘要】
一种褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于分子生物学以及蛋白质工程领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶突变体
Pl7MaM
及其制备方法与应用
。

技术介绍

[0002]作为一种海洋酸性多糖，褐藻胶主要来源于海带
、
昆布
、
马尾藻等褐藻
。
褐藻胶是一种线性多糖，由
β
‑
D
‑
甘露糖醛酸和
α
‑
L
‑
古洛糖醛酸通过
α
/
β
‑
1,4 糖苷键随机排列而成
。
作为一种生物大分子，褐藻胶具有分子量大
、
水溶性差及生物利用度低等缺点，限制其在许多领域的应用
。
但是其降解产物褐藻胶寡糖，具有良好的水溶性和生物利用率，此外还展现出更多的生物活性如抗氧化
、
抑菌等，在许多领域具有很好的应用价值
。
[0003]迄今，褐藻胶降解方法主要包括物理法
、
化学法和酶法
。
相比于物理法和化学法，酶法具有绿色环保
、
反应条件温和且反应过程可控
、
产物结构完好等优势，逐渐成为褐藻胶降解的主要方法
。
褐藻胶裂解酶作为专一性水解褐藻胶的工具，其来源广泛，其中细菌来源的褐藻胶裂解酶具有作用
pH
广
、
>催化活性高等优势
。
微泡菌属来源褐藻胶裂解酶作为细菌来源的重要组成部分，其分泌的褐藻胶裂解酶在褐藻胶寡糖制备领域发挥重要作用
。
[0004]因此，为了扩大褐藻胶裂解酶的应用范围，对褐藻胶裂解酶的进一步研究具有重要的现实意义
。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术提供了一种褐藻胶裂解酶突变体
Pl7MaM
及其制备方法与应用，有效提升了酶活力和热稳定性，为下一步应用奠定了基础
。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种褐藻胶裂解酶突变体
Pl7MaM
，所述氨基酸序列如
SEQ ID NO.8
所示
。
[0007]优选地，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列如
SEQ ID NO.7
所示
。
[0008]本专利技术还提供了一种所述褐藻胶裂解酶突变体
Pl7MaM
的制备方法，制备过程如下：以褐藻胶裂解酶
Pl7Ma
为出发模板，首先通过截短不同蛋白功能模块获得
Pl7Ma2
；然后以
Pl7Ma2
为模板，通过结合二硫键和温度因子优化两种蛋白质理性设计策略，即得
Pl7MaM。
[0009]优选地，所述褐藻胶裂解酶
Pl7Ma
的氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；所述
Pl7Ma2
的氨基酸序列如
SEQ ID NO.6
所示
。
[0010]优选地，编码所述褐藻胶裂解酶
Pl7Ma
氨基酸序列的多聚核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；编码所述
Pl7Ma2
氨基酸序列的多聚核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示
。
[0011]本专利技术还提供了一种重组表达载体
pPICZ
α
A
‑
pl7MaM
，包括所述褐藻胶裂解酶突变体
Pl7MaM
的多聚核苷酸序列
。
[0012]本专利技术还提供了一种重组工程菌，包括所述的重组表达载体
pPICZ
α
A
‑
pl7MaM。
[0013]优选地，所述的重组工程菌以毕赤酵母工程菌作为宿主
。
[0014]优选地，所述毕赤酵母工程菌包括毕赤酵母
X33。
[0015]本专利技术还提供了一种所述的褐藻胶裂解酶突变体
Pl7MaM
在制备海藻寡糖中的应用
。
[0016]因此，本专利技术的目的通过下述技术方案实现：（1）根据毕赤酵母密码子偏好性，优化合成褐藻胶裂解酶
Pl7Ma
编码基因
Pl7ma
，并以毕赤酵母为宿主进行异源表达，获得重组褐藻胶裂解酶
Pl7Ma
；（2）通过分析褐藻胶裂解酶
Pl7Ma
蛋白内部功能元件，分别构建不同长度褐藻胶裂解酶，获得酶活力提升的
Pl7Ma2
；（3）以
Pl7Ma2
为出发模板，定向增加其内部二硫键，获得热稳定性提升的二硫键突变体
Pl7Ma2
‑
T112C/A261C
；（4）以二硫键突变体
Pl7Ma2
‑
T112C/A261C
为模板，优化其温度因子
B
‑
factor
，结合单点突变和组合突变，获得热稳定性提升的突变体
Pl7MaM
；（5）突变体
Pl7MaM
特性表征及其制备海藻寡糖
。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的具有以下优势：本专利技术以来源于
Microbulbifer agarilyticus
的褐藻胶裂解酶
Pl7Ma
为研究对象，根据毕赤酵母密码子偏好性，优化合成目标基因
pl7ma
并在毕赤酵母实现重组表达；并通过截短不同蛋白功能元件获得酶比活提升的
Pl7Ma2
；最终结合二硫键理性设计和温度因子优化两种方法获得
Pl7MaM
，其在
45℃、50℃
和
55℃
的水浴处理
60
分钟后的剩余酶活分别是
Pl7Ma
的
3.14
倍
、4.83
倍和
6.52
倍，酶活力及热稳定性均显著提升，可进一步用于制备海藻寡糖，为下一步产业化应用奠定了坚实基础
。
附图说明
[0018]图1为褐藻胶裂解酶
Pl7Ma
温度特性和
pH
特性图；图2为褐藻胶裂解酶
Pl7Ma
及其截短突变体
Pl7Ma1
和
Pl7Ma2
三维构象；图3为
Pl7Ma2
及其突变体
Pl7Ma2
‑
T112C/A261C
和
Pl7MaM
三维构象；图4为突变体
Pl7MaM
最适反应温度和热稳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种褐藻胶裂解酶突变体
Pl7MaM
，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶突变体
Pl7MaM
的氨基酸序列如
SEQ ID NO.8
所示
。2. 如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体
Pl7MaM
，其特征在于，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列如
SEQ ID NO.7
所示
。3.
一种如权利要求1‑2任一项所述褐藻胶裂解酶突变体
Pl7MaM
的制备方法，其特征在于，制备过程如下：以褐藻胶裂解酶
Pl7Ma
为出发模板，首先通过截短不同蛋白功能模块获得
Pl7Ma2
；然后以
Pl7Ma2
为模板，通过结合二硫键和温度因子优化两种蛋白质理性设计策略，即得
Pl7MaM。4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶
Pl7Ma
的氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；所述
Pl7Ma2
的氨基酸序列如
SEQ ID NO.6
所示

【专利技术属性】
技术研发人员：王建荣，祝木金，王平，陈微，钟斌，高美芳，曹革，
申请(专利权)人：深圳润康生态环境股份有限公司，
类型：发明
国别省市：