白千层醇合成酶制造技术

本发明专利技术公开了白千层醇合成酶

【技术实现步骤摘要】
白千层醇合成酶Agr5突变体及其编码基因与应用


[0001]本专利技术属于酶基因工程及酶工程领域，具体涉及一种来源于茶树菇
(Agrocybe aegerita)
的白千层醇合成酶
Agr5
突变体及其编码基因与应用
。

技术介绍

[0002]白千层醇具有抗感染
、
抗病毒
、
抗菌
、
抗寄生虫的药学属性，而且是开发化妆品有益成分的潜力分子
。
一些用于食品
、
饮料
、
医药产品
、
化妆品和口腔护理产品的风味组合物中的味觉改进剂中也有添加适量的白千层醇等萜类化合物来进行增味提香
。
[0003]目前萜类化合物依旧通过植物提取或者化学合成为主，有限的自然资源限制了萜类化合物的高效生产
。
植物提取或者化学合成所得的一些倍半萜化合物成本较高，而合成生物学应用于萜类天然产物的高效生物合成，可以有效降低生产成本，利润可观
。
目前国内外已经有报道一些萜类化合物如橙花叔醇
、
荜澄茄醇和瓦伦烯等的高效生物合成
。
[0004]萜类化合物的高效生物合成离不开高效的催化元件
。
通过代谢途径理性改造虽然可以增强目标产物的合成通量，但关键合成元件的催化效率会极大地影响最终产物的产量
。
倍半萜合酶属于
I
类萜类合酶，是可溶的酸性蛋白，分子量在
>35
～
80kDa
之间，通常具有两个高保守性区域即位于
α
螺旋上的
DDXXD
和
NSE/DTE
，催化反应一般需要3个二价金属离子如
Mg
2+
。
天然倍半萜合酶的催化效率通常较低，难以满足高效生物合成的要求，而对倍半萜合酶催化活性提升的研究较少，且目前多数突变研究未得到理想效果，这也极大地限制了倍半萜类天然产物的应用
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供白千层醇合成酶
Agr5
突变体
。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供上述白千层醇合成酶
Agr5
突变体的编码基因
。
[0007]本专利技术的第三个目的是提供包含上述编码基因的重组质粒
。
[0008]本专利技术的第四个目的是提供包含上述重组质粒的工程菌
。
[0009]本专利技术的第五个目的是提供上述工程菌发酵合成白千层醇的应用
。
[0010]本专利技术的技术方案概述如下：
[0011]白千层醇合成酶
Agr5
突变体，其特征在于所述白千层醇合成酶
Agr5
突变体为下列之一：
[0012]SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
175
位酪氨酸突变为苯丙氨酸，如
SEQ ID NO.2
所示；
[0013]SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
190
位丙氨酸突变为丝氨酸，如
SEQ ID NO.3
所示；
[0014]SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
203
位酪氨酸突变为苯丙氨酸，如
SEQ ID NO.4
所示；
[0015]SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
209
位缬氨酸突变为异亮氨酸，如
SEQ ID NO.5
所示；
[0016]SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
209
位缬氨酸突变为亮氨酸，如
SEQ ID NO.6
所示；
[0017]SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
368
位丙氨酸突变为丝氨酸，如
SEQ ID NO.7
所示；
[0018]SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
372
位丙氨酸突变为脯氨酸，如
SEQ ID NO.8
所示；
[0019]SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
190
位丙氨酸突变为丝氨酸
+
第
209
位缬氨酸突变为异亮氨酸
+
第
368
位丙氨酸突变为丝氨酸
+
第
372
位丙氨酸突变为脯氨酸，如
SEQ ID NO.9
所示；
[0020]上述白千层醇合成酶突变体的编码基因
。
[0021]包含上述白千层醇合成酶突变体的编码基因的重组质粒
。
[0022]包含上述重组质粒的工程菌
。
[0023]上述工程菌发酵合成白千层醇的应用
。
[0024]上述应用包括如下步骤：将上述工程菌接种到尿嘧啶缺陷型选择性培养基中发酵，在发酵
24h
时添加终浓度为
10g/L
的半乳糖进行蛋白的诱导表达，同时添加终体积浓度
10
％的正十二烷发酵培养，在发酵
30h
时添加终体积浓度为
10g/L
的无水乙醇，在发酵
54h
时添加终体积浓度为
10g/L
的无水乙醇，共发酵
120h
，得到包含白千层醇的产物
。
[0025]本专利技术的优点：本专利技术利用基因工程和酶工程的手段，提供了白千层醇合酶
Agr5
突变体及其编码基因与应用，通过提供催化活性提高的白千层醇合成酶
Agr5
突变体，首次在酿酒酵母中合成白千层醇并提高白千层醇的产量，为白千层醇的工业化生产创造了条件
。
附图说明
[0026]图1为白千层醇合成酶
Agr5
的三维结构模型图；
[0027]图2为白千层醇合成酶
Agr5
的基因表达载体的质粒示意图；
[0028]图3为工程菌的白千层醇产量图
。
具体实施方式
[0029]以下结合具体实施例，对本专利技术做进一步说明
。
应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限制本专利技术的范围
。
[0030]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如
《
分子克隆：实验室手册
》(New York
：
Cold Spring Harbor Laboratory Press
，
1989)
中所述的条件进行
。
引物和序列为金唯智生物科技有限公司合成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
白千层醇合成酶
Agr5
突变体，其特征在于所述白千层醇合成酶
Agr5
突变体为下列之一：
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
175
位酪氨酸突变为苯丙氨酸，如
SEQ ID NO.2
所示；
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
190
位丙氨酸突变为丝氨酸，如
SEQ ID NO.3
所示；
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
203
位酪氨酸突变为苯丙氨酸，如
SEQ ID NO.4
所示；
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
209
位缬氨酸突变为异亮氨酸，如
SEQ ID NO.5
所示；
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
209
位缬氨酸突变为亮氨酸，如
SEQ ID NO.6
所示；
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
368
位丙氨酸突变为丝氨酸，如
SEQ ID NO.7
所示；
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列第
372
位丙氨酸突变为脯氨酸，如
SEQ ID NO.8<...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫晓光，乔建军，卢亚莉，聂升鑫，梁冬梅，李伟国，
申请(专利权)人：天津大学浙江研究院绍兴，
类型：发明
国别省市：