一种重建卡尔文循环提高异养微生物代谢产物产量的方法技术

本发明专利技术涉及基因工程及发酵工程技术领域，具体涉及一种重建卡尔文循环提高异养微生物代谢产物产量的方法。本发明专利技术通过调控卡尔文循环相关基因的表达，重建异养微生物的卡尔文循环，有效促进了异养微生物对油脂碳源的代谢，促进其β

【技术实现步骤摘要】
一种重建卡尔文循环提高异养微生物代谢产物产量的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程及发酵工程
，具体涉及一种重建卡尔文循环提高异养微生物代谢产物产量的方法。

技术介绍

[0002]聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的可再生、可降解且具有多元材料学性能的高分子聚合物，在医学、材料和环保领域具有广泛的应用前景。聚羟基脂肪酸酯广泛存在于微生物细胞内，主要作为碳源及能量的贮存载体。
[0003]罗氏真养菌(Ralstonia eutropha，又名Cupriavidus necator)是一种异养微生物，也是研究PHA合成的重要模式细菌，如何提高罗氏真养菌的PHA产量是当前研究的热点与难点。
[0004]卡尔文循环(CBB循环)，又称光合碳循环，是自然界中广泛存在的固碳途径之一，但在自然环境下主要存在于自养微生物中。
[0005]CBB循环相关基因在罗氏真养菌中存在两个拷贝，分别位于2号基因组和大质粒pHG1，其中在2号基因组上的cbbR负责调控2号基因组和pHG1上的cbb基因簇，位于大质粒pHG1上的cbbR因不完整而不具备调控能力(Genome sequence of the bioplastic
‑
producing“Knallgas”bacterium Ralstonia eutropha H16，Nature biotechnology，2006)。
[0006]现有技术报道了一些通过在异养微生物中外源表达CBB循环关键酶(如RuBisCo)以使得异养微生物减少二氧化碳排放的技术方案，但目前未见利用CBB循环影响异养微生物目标代谢产物产量的报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供一种重建卡尔文循环提高异养微生物代谢产物产量的方法。
[0008]本专利技术发现，调控卡尔文循环中的关键基因的表达能够促进异养微生物对油脂碳源的代谢，促进β
‑
氧化循环的运转，进而促进代谢流进入代谢产物的合成途径，提高异养微生物利用油脂碳源合成目标代谢产物的能力。
[0009]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0010]本专利技术提供卡尔文循环相关基因或其编码蛋白或含有所述卡尔文循环相关基因的生物材料的以下任一种应用：
[0011]1)在提高微生物利用油脂合成代谢产物的能力中的应用；
[0012]2)在提高微生物利用油脂生产代谢产物的产量中的应用；
[0013]3)在提高微生物利用油脂生产代谢产物的生产效率中的应用；
[0014]4)在构建用于利用油脂生产代谢产物的工程化微生物中的应用；
[0015]5)在提高微生物对油脂的代谢能力中的应用；
[0016]6)在促进微生物的β
‑
氧化循环中的应用；
[0017]所述卡尔文循环相关基因为cbbL和cbbS。
[0018]本专利技术所述的cbbL基因和cbbS基因分别负责合成核酮糖
‑
1,5
‑
二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大亚基和小亚基，进而合成核酮糖
‑
1,5
‑
二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)。
[0019]本专利技术所述的生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。其中，表达盒可由启动子和所述卡尔文循环相关基因可操作性地连接得到。根据表达需要以及表达盒上下游序列的不同，表达盒中还可包含终止子、增强子等其他转录、翻译调控元件。所述载体为质粒载体，这些质粒载体包括复制型载体和非复制型载体，载体不局限于质粒载体，还可为噬菌体、病毒等载体。所述宿主细胞可为任意的微生物细胞，例如大肠杆菌、罗氏真养菌等。
[0020]具体地，所述应用包括：提高微生物中卡尔文循环相关基因的表达量和/或提高卡尔文循环相关基因的编码蛋白的酶活性。
[0021]优选地，提高微生物中卡尔文循环相关基因的表达为将cbbL的表达量提高至调控前的2
‑
141倍，且cbbL与cbbS的表达量之比为(0.5
‑
1.2)：1。将cbbL的表达量提高幅度以及cbbL与cbbS的表达量之比控制在上述范围内，能够显著提升微生物的PHA生产能力，其PHA含量和PHA产量均显著提升。
[0022]进一步优选地，cbbL与cbbS的表达量之比为(0.5
‑
0.97)：1。更优选(0.57
‑
0.91)：1。
[0023]cbbL和cbbS分别编码Rubisco酶的大小亚基，因此理论上二者的最优表达量之比应该为1:1，然而本专利技术意外地发现，当控制cbbL与cbbS的表达量比例在(0.5
‑
0.97)：1之间时，微生物的PHA产量提升效果仍然十分突出；与此同时，需要控制cbbL的表达量提升幅度为调控前的2
‑
141倍，以更好地保证PHA产量的提升效果。
[0024]进一步优选地，提高微生物中卡尔文循环相关基因的表达量为将cbbL的表达量提高至调控前的2
‑
70倍(更优选为2
‑
65倍)，且cbbL与cbbS的表达量之比为(0.5
‑
1.1)：1(更优选为0.57
‑
0.97：1，最优选为0.57
‑
0.91：1)。
[0025]在满足上述cbbL表达量提升比例以及cbbL与cbbS的表达量之比的条件下，优选cbbS的表达量提高至调控前的2
‑
150倍，更优选为2
‑
70倍。
[0026]本专利技术所述的提高cbbL、cbbS基因的表达量可通过以下1)
‑
4)中的任意一种或多种方式的组合实现：
[0027]1)修饰cbbL、cbbS的调控蛋白；
[0028]2)修饰cbbL、cbbS的转录调控元件和/或翻译调控元件；
[0029]3)修饰cbbL、cbbS基因的序列；
[0030]4)增加cbbL、cbbS的拷贝数。
[0031]上述1)中，所述调控蛋白包括cbbR蛋白。所述修饰cbbL、cbbS的调控蛋白为通过突变cbbR蛋白使得cbbR对cbbL、cbbS基因的调控方式改变，进而提高cbbL、cbbS基因的表达量。
[0032]在本专利技术的一些实施方式中，将cbbR蛋白突变为含有G205D、G118D突变的cbbR突变体。优选地，所述cbbR突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。SEQ ID NO.5所示的cbbR突变体尤其适用于激活罗氏真养菌在异养条件下提高cbbL和cbbS基因的表达量，可使得cbbL、cbbS的表达量提高至本专利技术所述的比例范围内，进而显著提高PHA的产量。
[0033]上述cbbR突变体的引入可通过在微生物的染色体或内源质粒上引入cbbR突变体编码基因实现，和/或，通过向微生物中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.卡尔文循环相关基因或其编码蛋白或含有所述卡尔文循环相关基因的生物材料的以下任一种应用：1)在提高微生物利用油脂合成代谢产物的能力中的应用；2)在提高微生物利用油脂生产代谢产物的产量中的应用；3)在提高微生物利用油脂生产代谢产物的生产效率中的应用；4)在构建用于利用油脂生产代谢产物的工程化微生物中的应用；5)在提高微生物对油脂的代谢能力中的应用；6)在促进微生物的β
‑
氧化循环中的应用；所述卡尔文循环相关基因为cbbL和cbbS。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：提高微生物中所述卡尔文循环相关基因的表达量和/或提高所述卡尔文循环相关基因的编码蛋白的酶活性；优选地，所述提高微生物中所述卡尔文循环相关基因的表达量为将cbbL的表达量提高至调控前的2
‑
141倍，且cbbL与cbbS的表达量之比为(0.5
‑
1.2)：1。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述卡尔文循环相关基因来源于异养微生物；优选来源于罗氏真养菌、大肠杆菌、酵母菌、假单胞菌或盐单胞菌；和/或，所述微生物为异养微生物，优选为罗氏真养菌、大肠杆菌、酵母菌、假单胞菌或盐单胞菌。4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述代谢产物以β
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：丰婧，杨晓妍，陈丽媛，范丁丁，张桦宇，张震，邹亮，李明月，郑鹏玉，赵长春，吴雅琨，尹进，汪东升，饶驰通，李腾，张浩千，
申请(专利权)人：北京蓝晶微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：