本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及柠檬烯合成酶突变体及柠檬烯生产工程菌
【技术实现步骤摘要】
柠檬烯合成酶突变体及柠檬烯生产工程菌
[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及柠檬烯合成酶突变体及柠檬烯生产工程菌
。
技术介绍
[0002]柠檬烯是一种具有重要生理学活性的环状单萜，因其具有令人愉悦的香气
、
特殊的生物活性
(
抗癌
、
抗炎
、
抗菌
、
镇咳等
)
和良好的理化特性
(
易挥发
、
低毒性等
)
而被广泛应用于食品
、
药品
、
清洁日化品
、
化妆品
、
农药
。
柠檬烯的脂溶性和较低的冰点使其成为第三代航空燃料的理想候选原料
。
由于柠檬烯广泛的应用使其全球市场的需求持续增长，预计到
2024
年，全球市场规模将超过
1.9
亿美元
。
[0003]目前柠檬烯主要来源是柑橘类
(
如柠檬
、
柑橘等
)
植物提取，存在含量低
、
培养周期长，产能受限，无法满足当今社会绿色可持续生产的要求
。
构建高效的异源合成柠檬烯微生物细胞工厂，实现微生物发酵法替换传统的植物提取法，具有重要的经济与社会效益
。
但是柠檬烯合成酶作为柠檬烯合成途径的关键酶，在微生物体内的催化活性还比较低，目前针对柠檬烯合成酶的改造研究较少
。
技术实现思路
[0004]有鉴于此，本专利技术提供的柠檬烯合成酶突变体及柠檬烯生产工程菌，通过半理性设计的方式对柠檬烯合成酶
CltLS2
进行突变改造，使其具有更高的活性，并在酿酒酵母中进行表达
。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了柠檬烯合成酶的突变体，突变位点包括
H520F
，
H520Y
，
H520V
，
K164A
，
K164R
，
E471L
，
E467A
，
E466L
，
R470L
，
R470F
，
K474R
，
L515G
或
Y514L
中的一种或两种；
[0007]所述柠檬烯合成酶的氨基酸序列如
SEQ ID NO:3
所示
。
[0008]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述突变体具有：
[0009](1)、
如
SEQ ID NO:4
所示的氨基酸序列；或
[0010](2)、
如
(1)
所示的氨基酸序列经取代
、
缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与
(1)
的相同或相似；或
[0011](3)、
与如
(1)
或
(2)
所示的氨基酸序列至少有
90
％同源性的氨基酸序列；
[0012]所述多个为2个至
50
个
。
[0013]本专利技术还提供了核酸分子，具有编码上述突变体的核苷酸序列
。
[0014]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述核酸分子具有：
[0015](4)、
如
SEQ ID NO:2
所示的核苷酸序列；或
[0016](5)、
如
(4)
所示的核苷酸序列经取代
、
缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与
(4)
的相同或相似；或
[0017](6)、
与如
(4)
或
(5)
所示的核苷酸序列至少有
90
％同源性的核苷酸序列；
[0018]所述多个为2个至
160
个
。
[0019]本专利技术还提供了生产柠檬烯的工程菌，包括上述核酸分子
。
[0020]本专利技术还提供了合成柠檬烯的工程菌的构建方法，包括将上述核酸分子与
NDPS1
基因构建成表达盒，再将表达盒整合至宿主细胞，完成工程菌构建；
[0021]所述工程菌包括酿酒酵母；
[0022]所述酿酒酵母包括酿酒酵母重组菌
。
[0023]本专利技术还提供了如下任意项在合成柠檬烯中的应用：
[0024](a)、
上述突变体；
(b)、
上述核酸分子；
(c)、
上述工程菌
。
[0025]本专利技术还提供了合成柠檬烯的方法，基于上述突变体
、
上述核酸分子或上述工程菌合成或构建
。
[0026]本专利技术还提供了酶，其具有：
[0027]所述柠檬烯合成酶突变体包含如下氨基酸突变的一种或两种组合：
H520F
，
H520Y
，
H520V
，
K164A
，
K164R
，
E471L
，
E467A
，
E466L
，
R470L
，
R470F
，
K474R
，
L515G
，
Y514L。
[0028]突变体
H520F
代表第
520
位的组氨酸突变为苯丙氨酸，突变体
H520Y
代表第
520
位的组氨酸突变为酪氨酸，突变体
H520V
代表第
520
位的组氨酸突变为缬氨酸，突变体
K164A
代表第
164
位的赖氨酸突变为丙氨酸，突变体
K164R
代表第
164
位的赖氨酸突变为精氨酸，突变体
E471L
代表第
471
位的谷氨酸突变为亮氨酸，突变体
E467A
代表第
467
位的谷氨酸突变为丙氨酸，突变体
E466L
代表第
466
位的谷氨酸突变为亮氨酸，突变体
R470L
代表第
470
位的精氨酸突变为亮氨酸，突变体
R470F
代表第
470
位的精氨酸突变为苯丙氨酸，突变体
K474R
代表第
474
位的赖氨酸突变为精氨酸，突变体
L515G
代表第
515
位的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.
柠檬烯合成酶的突变体，其特征在于，具有如下突变中的任一种：
(A)、H520F
；
(B)、H520Y
；
(C)、H520V
；
(D)、E471L
；
(E)、E467A
；
(F)、K474R
；
(G)、L515G
；
(H)、H520F、K474R
；
(I)、H520F、E471L
；所述柠檬烯合成酶的氨基酸序列如
SEQ ID NO:3
所示
。2.
如权利要求1所述的突变体，其特征在于，具有：
(1)、
如
SEQ ID NO:4
所示的氨基酸序列；或
(2)、
如
(1)
所示的氨基酸序列经取代
、
缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与
(1)
的相同或相似；或
(3)、
与如
(1)
或
(2)
所示的氨基酸序列至少有
90
％同源性的氨基酸序列；...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵广荣，关蕾蕾，乔建军，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：
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