一种立体选择性提高的苏氨酸醛缩酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种立体选择性提高的苏氨酸醛缩酶突变体及其应用

【技术实现步骤摘要】
Asn Val Phe Leu Arg Leu Ser Ser Gly Glu Ser Ala ProLeu Leu Ala Phe Met Lys Glu Arg Gly Ile Leu Phe Ser Gly Tyr Gly Glu Leu Arg Leu ValThr His Leu Gln Ile Asn Asp Asp Asp Ile Glu Glu Val Ile Asp Ala Phe Thr Glu Tyr Met GlyArg。
[0008]本专利技术提供了编码所述
M282N
突变体的核苷酸序列，如
SEQ ID NO.2
所示；
[0009]SEQ ID NO.2
：
atgggccgtt acatcgatct gcgtagcgac accgtgaccc agccgaccga tgcgatgcgt caaagcatgc tgcacgcgga agtgggcgac gatgtttatg gcgaggaccc gagcattaac gcgctggagcgtcgtggcgc ggaactgctg ggtaaagagg cggcgctgtt tgtgccgagc ggtaccatga gcaacctgctggcgatgatg agccattgcc agcgtggcga gggtgcggtt ctgggtaacg cggcgcacat ttaccgttatgaagcgcaag gcagcgcggt tctgggtagc gttgcgctgc agccggtgcc gatgcaggcg gatggtaccctggcgctggc ggatgttcgt gcggcgattg cgccggatga tgcgcacttc gcgcaaaccc gtctgatttgcctggagaac acccacaacg gtaaagtgct gccgctggcg tacctgcacg aaatgcgtcg tttcgcggatagccaaggtc tgcgtctgca cctggacggt gcgcgtctgt ttaacgcggt ggttgcgagc ggtcaagcggtgcatgagat tgcggcgccg tttgatagcg ttagcatttg cctgagcaaa ggtctgggtg cgccggtgggcagcctgctg gttggtgcgc aggacctgat tgcgcgtgcg cgtcgtctgc gtaaaatgct gggtggcggtatgcgtcagg cgggcagcct ggcgcaagcg ggtctgtttg cgctggaaca acacgttacc cgtctggcggatgatcaccg tcgtgcgcgt cgtctggcgg aaggtctggc ggcgctgccg ggtattgagc tggacccggacctggtgcag accaacaacg tttttctgcg tctgagcagc ggtgaaagcg cgccgctgct ggcgttcatgaaggagcgtg gtatcctgtt tagcggctac ggtgaactgc gtctggtgac ccacctgcag attaacgacgatgacatcga ggaagttatt gatgcgttta ccgagtatat gggtcgttaa。
[0010]本专利技术提供了所述突变体基因的表达载体
。
[0011]本专利技术提供了所述表达载体的基因工程菌
。
[0012]作为优选，所述基因工程菌为
E.coli BL21(DE3)。
[0013]本专利技术还提供了所述基因工程菌在制备
β
‑
羟基
‑
α
‑
氨基酸中的应用
。
[0014]作为优选，以培养所述基因工程菌得到的苏氨酸醛缩酶突变体作为催化剂，以醛为底物
、
甘氨酸为辅底物
、
磷酸吡哆醛为辅酶进行催化反应，合成
β
‑
羟基
‑
α
‑
氨基酸
。
[0015]作为优选，所述催化反应在有机溶剂
‑
水混合溶液或水溶液中进行
。
[0016]作为优选，所述有机溶剂为
DMSO
，所述
DMSO
的体积分数为5～
15
％
。
[0017]本专利技术具有以下有益效果：
[0018]本专利技术在构建苏氨酸醛缩酶突变体库后，建立反应体系与反应检测体系，筛选出酶活和立体选择性好均较好的突变体，用于高产率
、
高选择性的催化合成
β
‑
羟基
‑
α
‑
氨基酸
。
附图说明
[0019]图1为图1为生物法合成
L
‑
苯基丝氨酸的方程式；
[0020]图2为苏氨酸醛缩酶突变体
M282N
蛋白胶图；
[0021]图3为底物苯甲醛显色反应酶标仪结果图；
[0022]图4为为苯甲醛标准曲线；
[0023]图5为
AeLTA
‑
M282N
全细胞催化和细胞破碎液催化产物和甘氨酸的进程图；
[0024]图6为产物
L
‑
对甲砜基苯丝氨酸反应液液相质谱图图谱
。
具体实施方式
[0025]本具体实施方式仅仅是对本专利技术的解释，并不是对本专利技术的限制，本领域技术人员在阅读了本专利技术的说明书之后所做的任何改变，只要在权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护
。
[0026]实施例1：突变质粒的构建
[0027]1、
质粒
pET28a(+)
‑
AeLTA
的获得
[0028]将来源于
Aeromonas encheleia
的重组菌
E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)
‑
AeLTA
接种于培养基装液量
5mL
试管中于
37℃、220rpm
振荡培养
12h。
培养结束后，将菌体于
13,000rpm
下离心
1min
并收集细胞，利用高纯度质粒小提试剂盒，从
E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)
‑
AeLTA
中提取质粒作为迭代突变的模板，进行质粒
pET28a(+)
‑
AeLTA
的构建
。
[0029]2、
重组大肠杆菌
E.coli BL21(DE3)/pET
‑
28a(+)
‑
AeLTA
突变体的构建
[0030本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种立体选择性提高的苏氨酸醛缩酶突变体，其特征在于：所述突变体为
M282N
突变体，对应氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；
SEQ ID NO.1
：
Met Arg Tyr Ile Asp Leu Arg Ser Asp Thr ValThr Gln Pro Thr Asp Ala Met Arg Gln Ser Met Leu His Ala Glu Val Gly Asp Asp Val Tyr Gly Glu Asp Pro Ser IleAsn Ala Leu Glu Arg Arg Gly Ala Glu Leu Leu Gly Lys Glu Ala Ala Leu Phe Val Pro SerGly Thr Met Ser Asn Leu Leu Ala Met Met Ser His Cys Gln Arg Gly Glu Gly Ala Val LeuGly Asn Ala Ala His Ile Tyr Arg Tyr Glu Ala Gln Gly Ser Ala Val Leu Gly Ser Val Ala LeuGln Pro Val Pro Met Gln Ala Asp Gly Thr Leu Ala Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Ile Ala ProAsp Asp Ala His Phe Ala Gln Thr Arg Leu Ile Cys Leu Glu Asn Thr His Asn Gly Lys ValLeu Pro Leu Ala Tyr Leu His Glu Met Arg Arg Phe Ala Asp Ser Gln Gly Leu Arg Leu HisLeu Asp Gly Ala Arg Leu Phe Asn Ala Val Val Ala Ser Gly Gln Ala Val His Glu Ile Ala AlaPro Phe Asp Ser Val Ser Ile Cys Leu Ser Lys Gly Leu Gly Ala Pro Val Gly Ser Leu Leu ValGly Ala Gln Asp Leu Ile Ala Arg Ala Arg Arg Leu Arg Lys Met Leu Gly Gly Gly Met ArgGln Ala Gly Ser Leu Ala Gln Ala Gly Leu Phe Ala Leu Glu Gln His Val Thr Arg Leu AlaAsp Asp His Arg Arg Ala Arg Arg Leu Ala Glu Gly Leu Ala Ala Leu Pro Gly Ile Glu LeuAsp Pro Asp Leu Val Gln Thr Asn Asn Val Phe Leu Arg Leu Ser Ser Gly Glu Ser Ala ProLeu Leu Ala Phe Met Lys Glu Arg Gly Ile Leu Phe Ser Gly Tyr Gly Glu Leu Arg Leu ValThr His Leu Gln Ile Asn Asp Asp Asp Ile Glu Glu Val Ile Asp Ala Phe Thr Glu Tyr Met GlyArg。2.
编码权利要求1所述
M282N
突变体的核苷酸序列，其特征在于：如
SEQ ID NO.2
所示；
SEQ ID NO.2
：
atgggccgtt acatcgatct gcgtagcgac a...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，蔡雪，严艳风，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：