一种高活性酪氨酸解氨酶及其突变体和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高活性酪氨酸解氨酶及其突变体和应用

【技术实现步骤摘要】
一种高活性酪氨酸解氨酶及其突变体和应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种高活性酪氨酸解氨酶及其突变体和应用
。

技术介绍

[0002]咖啡酸是一种植物特异性苯丙酸，广泛存在于中草药植物中
。
具有抗氧化
、
抗肿瘤和脑保护等多种药理作用，还有收缩增固微血管，促进凝血因子功能，升高白血球及血小板之功效，用于白细胞
、
血小板减少症的治疗，具有较高的临床应用价值
。
[0003]咖啡酸可通过植物提取法获得，但由于咖啡酸在植物中含量较低，提取较为困难
。
咖啡酸也可通过化学方法合成，但也存在副产物较多，收率较低等问题
。
生物合成法通常具有反应条件温和，成本低，转化率高等特点，但同时也受限于酪氨酸解氨酶的低活性，导致咖啡酸的产量不甚理想
。
酪氨酸解氨酶属于芳香族氨基酸裂解酶，倾向于以酪氨酸或左旋多巴为底物，催化酪氨酸或左旋多巴脱氨生成对香豆酸或咖啡酸，为生产黄酮类化合物或白藜芦醇等芪合物等多种物质提供前体
。
该酶在植物中首次被发现，之后在真菌
、
担子菌等微生物体内被发现
。
在合成生物学中，为实现苯丙素类化合物代谢途径的通畅，采用高活性的酪氨酸解氨酶是其中关键一环
。
因此，需要通过生物信息学
、
基因工程和酶工程等手段筛选和获取高活性酪氨酸解氨酶，进而促进咖啡酸及其衍生物的生产
。
>
技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种高活性酪氨酸解氨酶及其突变体和应用，达到提高咖啡酸及其衍生物生物合成的目的，对实现工业化生产咖啡酸及其衍生物具有重要意义
。
[0005]本专利技术提供了一种通过基因挖掘技术筛选获得的酪氨酸解氨酶基因
。
以文献报道常用的酪氨酸解氨酶的氨基酸序列为模板，在
NCBI
数据库中进行
BLAST
比对分析，根据设定参数获得了一系列与模板氨基酸序列同源性不同的酪氨酸解氨酶，再通过构建系统发育树选择了几种有代表性的酪氨酸解氨酶，通过基因合成，外源表达，酶活测定，筛选获得一个高活性的来源于
Rhodotorula taiwanensis
的酪氨酸解氨酶，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，编码该氨基酸的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0006]本专利技术提供了一组酶活性提高的酪氨酸解氨酶突变体，是以氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示酪氨酸解氨酶为亲本，将第
252、380
和
415
位的氨基酸进行单突变或组合突变
。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将亲本第
252
位的异亮氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.3
所示
。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将亲本第
380
位的丙氨酸突变为谷氨酰胺，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
所示
。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将亲本第
415
位的苏氨酸分别突变为丙氨酸
、
半胱胺酸或蛋氨酸，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7
所示
。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将亲本第
252
位的异亮氨酸突变为谷氨酸，并将
380
位的丙氨酸突变为谷氨酰胺，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.8
所示
。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将亲本第
380
位的丙氨酸突变为谷氨酰胺并将第
415
位的苏氨酸突变为蛋氨酸，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.9
所示
。
[0012]本专利技术提供了编码所述突变体的基因，编码氨基酸序列如
SEQ ID NO.3
所示的突变体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.10
所示
。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，编码氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
所示的突变体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.11
所示
。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，编码氨基酸序列如
SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7
所示的突变体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14
所示
。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，编码氨基酸序列如
SEQ ID NO.8
所示的突变体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.15
所示
。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，编码氨基酸序列如
SEQ ID NO.9
所示的突变体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.16
所示
。
[0017]本专利技术提供了外源表达酪氨酸解氨酶及其突变体的表达载体
。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体以
pET24a
为出发载体
。
[0019]本专利技术提供了表达氨基酸序列如
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9
所示的酪氨酸解氨酶及其突变体，或含有所述编码基因及突变体基因的微生物细胞
。
[0020]本专利技术提供了一种微生物细胞，在所述微生物细胞中表达酪氨酸解氨酶
、
抗反馈抑制突变体3‑
脱氧
‑
D
‑
阿拉伯庚酮酸
‑7‑
磷酸合成酶
、
抗反馈抑制突变体分支酸变位酶
/
预苯酸脱氢酶和4‑
羟基苯乳酸
‑3‑
羟化酶
。
[0021]本专利技术提供了一种微生物发酵生产咖啡酸的方法，以甘油或葡萄糖为碳源，在发酵培养基中加入表达酪氨酸解氨酶
、
抗反馈抑制突变体3‑
脱氧
‑
D
‑
阿拉伯庚酮酸
‑7‑
磷酸合成酶
、
抗反馈抑制突变体分支酸变位酶
/
预苯酸脱氢酶和4‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于基因挖掘方法获得的酪氨酸解氨酶，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶的氨基酸序列为
SEQ ID NO.1。2.
编码权利要求1所述的酪氨酸解氨酶，其特征在于酪氨酸解氨酶的核苷酸序列为
SEQ ID NO.2。3.
一种酪氨酸解氨酶突变体，其特征在于以氨基酸序列为
SEQ ID NO.1
的酪氨酸解氨酶为亲本，将第
252、380
和
415
位的氨基酸进行单突变或组合突变
。4.
如权利要求3所述的突变体，其特征在于以序列为
SEQ ID NO.1
的酪氨酸解氨酶为亲本，经过如下任意一种情况的突变得到：
1)
将亲本第
252
位的异亮氨酸单突变为谷氨酸，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.3
所示；
2)
将亲本第
380
位的丙氨酸单突变为谷氨酰胺，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
所示；
3)
将亲本第
415
位的苏氨酸分别单突变为丙氨酸
、
半胱胺酸或蛋氨酸，其氨基酸序列分别如
SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6
或
SEQ ID NO.7
所示；
4)
将亲本第
252
位的异亮氨酸突变为谷氨酸，并将
380
位的丙氨酸突变为谷氨酰胺，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.8
所示；
5)
将亲本第
380
位的丙氨酸突变为谷氨酰胺，并将第
415
位的苏氨酸突变为蛋氨酸，其氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：张振宇，储消和，吴杰群，黄书生，柳鹏福，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：