一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学以及蛋白质工程领域，特别涉及一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用。本发明专利技术通过基因克隆获得几丁质酶ChiPc，进一步利用理性设计获得热稳定性提升的突变体ChiPcM，最终获得的突变体ChiPcM的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其热稳定性显著提高，在55℃、60℃和65℃热处理60分钟后的剩余酶活分别是出发模板ChiPc的2.1倍，5.1倍和9.8倍。本发明专利技术构建的几丁质酶突变体ChiPcM为其下一步产业化应用奠定基础。业化应用奠定基础。业化应用奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学以及蛋白质工程领域，特别涉及一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用。

技术介绍

[0002]几丁质作为自然界仅次于纤维素的自然多糖，由于其内部致密结晶结构，导致其溶解性差，从而限制其产业化应用。研究表明几丁质是由乙酰氨基葡萄糖通过糖苷键连接而成。几丁质降解形成聚合度小于10的几丁质寡糖，能够有效改善溶解性。此外有研究表明几丁质寡糖具有多种生物活性，以及良好的生物降解性和生物相容性，因此几丁质寡糖在许多领域具有巨大的应用潜力。目前几丁质寡糖的制备主要以化学法为主，通过强酸将几丁质降解成几丁质寡糖，此种工艺具有副产物多，产物结构不完整、污染环境等缺点。因此需要开发一种更绿色环保的方法用于几丁质寡糖的制备。
[0003]几丁质酶通过水解几丁质内部糖苷键，将几丁质转换为不同聚合度几丁质寡糖。根据几丁质酶来源可将几丁质酶分为动物、植物以及微生物来源。其中微生物来源几丁质酶具有作用pH广、催化活性高等特性，因此其更适合产业化应用。微生物来源几丁质酶进一步可细分为细菌和真菌来源几丁质酶。前期许多报道表明真菌来源几丁质酶具有酶比活高，作用温度广等特点。本课题组前期实验发现，丝状真菌厚垣普奇尼亚菌发酵液能够有效水解胶体几丁质。但是天然菌厚垣普奇尼亚菌发酵过程不稳定，限制其产业化应用。
[0004]因此，开发一种酶活性高，稳定性强的几丁质酶，对于扩大其产业化应用范围是十分重要的。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用。本专利技术提高了几丁质酶的热稳定性，为下一步应用奠定了基础。
[0006]本专利技术采用的技术方案具体如下：一种几丁质酶突变体ChiPcM，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]优选地，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]本专利技术还提供了一种重组表达载体pPICZαA
‑
chipcm，包含所述几丁质酶突变体ChiPcM的多聚核苷酸序列。
[0009]本专利技术还提供了一种重组菌株，包括所述的重组表达载体pPICZαA
‑
chipcm。
[0010]优选地，所述重组菌株以毕赤酵母工程菌作为宿主。
[0011]进一步优选地，所述毕赤酵母工程菌包括毕赤酵母X33。
[0012]本专利技术还提供了一种所述的几丁质酶突变体ChiPcM在制备几丁质寡糖中的应用。
[0013]本专利技术主要通过如下技术方案实现的：（1）基于同源RT
‑
PCR获得几丁质酶ChiPc及其编码基因chipc；（2）通过基因工程方法构建异源表达几丁质酶ChiPc重组毕赤酵母工程
菌；（3）纯化重组几丁质酶ChiPc并进行特性表征；（4）通过同源建模获得几丁质酶ChiPc三维构象，基于分子动力学模拟解析几丁质酶ChiPc蛋白柔性区域；（5）结合二硫键理性设计和优化蛋白结构自由能获得热稳定性提升几丁质酶突变体ChiPcM；（6）特性表征和分析突变体ChiPcM酶学特性；（7）高效制备重组几丁质酶突变体ChiPcM。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：本专利技术通过基因克隆获得厚垣普奇尼亚菌几丁质酶ChiPc编码基因chipc，通过理性设计二硫键和优化蛋白结构自由能获得热稳定性显著提升突变体ChiPcM，可以将突变体ChiPcM应用于酶法制备几丁质寡糖，有效扩大了几丁质的应用范围，并为下一步产业化应用奠定基础。
附图说明
[0015]图1几丁质酶ChiPc的pH特性图；图2几丁质酶ChiPc温度特性图；图3几丁质酶ChiPc及几丁质酶突变体ChiPcM三维构象图；图4高效制备几丁质酶突变体ChiPcM发酵曲线及蛋白电泳图；图5几丁质酶突变体ChiPcM温度特性图；图6 水解产物高效液相色谱图。
具体实施方式
[0016]下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本专利技术中涉及到的实验材料和试剂：1.菌株与载体：丝状真菌厚垣普奇尼亚菌（菌种编号BNCC354981）购自北京北纳创联生物技术研究院，保存于实验室
‑
60℃冰箱；毕赤酵母X33和表达载体pPICZαA均购自武汉淼灵生物科技有限公司。大肠杆菌感受态细胞Top10购自深圳辉诺生物技术有限公司。
[0017]2.酶与试剂盒：高保真Taq酶PrimeSTAR
®
HS (Premix)、Taq酶EmeraldAmp GTPCR Master Mix、反转录试剂盒RNA to cDNA EcoDry Premix以及限制性内切酶（SacI、EcoRI和NotI）均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；真菌总RNA提取试剂盒(DP419)、质粒提取试剂盒（#DP103
‑
03）、DNA 产物纯化试剂盒（#DP204）以及胶纯化试剂盒（#DP209
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02）均购自天根生化科技(北京)有限公司；Zeocin购自美国Invitrogen公司；几丁质酶购自上海源叶生物科技有限公司；其它化学试剂均购自上海麦克林生化科技有限公司。
[0018]3.培养基：厚垣普奇尼亚菌培养基为：液体PDA培养基，由马铃薯200克葡萄糖20克，蒸馏水1000毫升组成。
[0019]厚垣普奇尼亚菌产几丁质酶诱导培养基：由1.5% （w/v）蛋白胨，1.0%（w/v）胶体几丁质，0.1%（w/v）MgSO4•
7H2O，0.05%（w/v），FeSO4•
7H2O 和 0.3%（w/v） K2HPO4。
[0020]大肠杆菌培养基为LB，包括（1%（w/v）蛋白胨，0.5%（w/v）酵母提取物（上海源叶生物科技有限公司，MLP0021B），1%（w/v）NaCl， pH7.0），LBZ为LB培养基加25μg/mL Zeocin（博莱霉素）。
[0021]酵母培养基为YPD，包括（1%（w/v）酵母提取物，2%（w/v）蛋白胨，2%（w/v）葡萄糖）。
[0022]酵母筛选培养基为YPDZ（YPD培养基添加不同浓度的zeocin）。
[0023]酵母摇瓶培养基为BMGY培养基，包括 1％（w/v）酵母提取物、2％（w/v）蛋白胨、1.34％（w/v）YNB、0.00004％（w/v）Biotin、1％甘油(V/V)。
[0024]酵母摇瓶诱导培养基为BMMY培养基，除以0.5%（v/v）甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同。
[0025]注：YNB为酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种几丁质酶突变体ChiPcM，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2. 如权利要求1所述的几丁质酶突变体ChiPcM，其特征在于，编码所述突变体的序列为多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种重组表达载体pPICZαA
‑
chipcm，其特征在于，包含权利要求2所述的多聚核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建荣，祝木金，陈微，王平，钟斌，高美芳，曹革，
申请(专利权)人：深圳润康生态环境股份有限公司，
类型：发明
国别省市：