一种高活性壳聚糖酶的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种高活性壳聚糖酶的制备方法，涉及生物发酵的技术领域，包括菌株活化、种子制备、发酵培养和诱导表达。所述的菌种为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。所述的发酵培养和诱导表达包括四个阶段，分别为菌体富集阶段、甘油分批补料阶段、恒速流加诱导和溶氧反馈诱导阶段。本发明专利技术的制备方法解决了现有毕赤酵母发酵产壳聚糖酶中存在的诱导时间长、甲醇累积导致的菌体中毒及酶活性和表达量低的问题。本发明专利技术制备的壳聚糖酶发酵液中菌体湿重为470～500g/L，粗酶液的酶活为40000～50000U/mL，蛋白含量为17～20mg/mL，发酵时间为112～124h。为112～124h。

【技术实现步骤摘要】
一种高活性壳聚糖酶的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物发酵
，尤其是涉及一种高活性壳聚糖酶的制备方法。

技术介绍

[0002]甲壳素是自然界仅次于纤维素的第二大天然类生物质资源，经脱乙酰基后产物为壳聚糖。壳聚糖含有游离氨基，是天然多糖中唯一的碱性多糖，但其水溶性差，大大限制了壳聚糖的应用范围。壳聚糖经降解后的产物为壳寡糖，具有水溶性好、生物学活性强等优点，在医药领域、食品领域、农业领域、日用化工领域具有非常广泛的潜在应用价值。壳寡糖聚合度一般在2
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20之间，2014年国家卫计委批准壳寡糖为新资源食品，在食品工业中，壳寡糖聚合度为2～10。
[0003]目前壳寡糖常见的生产方法有物理降解法和化学降解法。物理降解法常见的是超声波降解法，该反应过程温和，可在低温下进行，环境污染较小，但是最终产物中壳寡糖收率很低，再加上成本过高，所以物理降解法难以工业化应用。化学降解法主要为酸法水解制备壳寡糖，是最早用于工业化生产壳寡糖的方法。该方法的技术要求相对较低，降解速度快，设备、原料成本较低，非常适合工业化生产。缺点是后处理工艺繁琐，环境污染严重，最重要的是制备的壳寡糖产物中单糖含量高，三聚以上寡糖收率低，分子量分布宽，副产物多，产品安全性受到质疑。
[0004]随着生物技术的不断发展，壳聚糖酶水解法逐渐被应用于壳寡糖的制备。2018年，国家卫健委第8号公告将壳聚糖酶列为食品添加剂新品种。壳聚糖酶正式作为食品工业用酶制剂生产壳寡糖。酶水解法制备壳寡糖，反应条件温和，易于控制，产物分子量分布均匀，单糖含量非常低，生产过程无需加入大量化学试剂，对环境污染小，而且无其它副产物，保证了产品安全性。
[0005]自然界中有许多微生物含有壳聚糖酶基因，但大部分野生菌株产酶活性极低。CN 113249260 B公开了一种野生水丛毛单胞菌SH
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50菌株经高密度发酵得到的壳聚糖酶粗酶液，酶活为46.4U/mL；CN 114214301 A公开了芽孢杆菌菌株发酵产壳聚糖酶的方法，最终酶活为5～50U/mL。
[0006]正因为如此，目前制备高活性壳聚糖酶的方法主要是通过基因重组将壳聚糖酶基因异源表达至大肠杆菌或酵母中获得。其中大部分壳聚糖酶的异源表达是通过大肠杆菌获得，但大肠杆菌产胞内酶，易形成包涵体，提取过程较繁琐费时；而通过酵母表达可获得胞外壳聚糖酶，但酵母产酶周期往往较长。
[0007]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于，提供一种高活性壳聚糖酶的制备方法，期望该方法获得的壳聚糖酶菌体浓度和蛋白含量高，酶活性强，且该方法的发酵时间短。
[0009]为了解决上述技术问题，实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种高活性壳聚糖酶的制备方法，包括：所述制备方法依次包括菌株活化、种子液培养、发酵培养、诱导表达和粗液分离；
[0011]所述发酵培养依次包括菌体富集阶段和甘油分批补料阶段，所述甘油分批补料阶段的具体步骤为：待培养基中甘油耗尽，溶氧回升至峰值后流加50％(w/v)的甘油水混合物，通过调整补料流速保持DO﹥25％，待菌体湿重达到100～130g/L后，流加甘油
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甲醇混合液，继续培养，直至菌体湿重达到200～250g/L；
[0012]所述诱导表达依次包括恒速流加诱导和溶氧反馈诱导，所述恒速流加诱导的具体步骤包括：甘油补料停止后，直接流加甲醇，甲醇流加速度为8～15ml/h/L初始发酵培养基，发酵温度控制为25～28℃，直至菌体湿重达到350～380g/L；
[0013]所述溶氧反馈诱导的具体步骤包括：流加甲醇
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糖醇混合液，DO控制为25～35％。
[0014]在可选的实施方式中，所述甘油
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甲醇混合液中甲醇的浓度(v/v)为0.1～0.5％。
[0015]在可选的实施方式中，所述的糖醇为选自甘露糖醇、山梨糖醇或麦芽糖醇中的至少一种。
[0016]在可选的实施方式中，所述甲醇
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糖醇混合液为甲醇与500g/L糖醇溶液的混合液，所述甲醇与糖醇溶液的质量比为4：1～2：1。
[0017]在可选的实施方式中，所述菌体富集阶段的培养条件包括：种子液的接种量为1％～5％(v/v)，培养温度为28～30℃，转速为480～520rpm，发酵罐压为0.04～0.06Mpa，通风比为1.0～1.5vvm，pH为4.8～5.2。
[0018]优选地，培养温度为30℃，转速为500rpm，发酵罐压为0.05Mpa，通风比为1.0vvm，pH为5.0。
[0019]在可选的实施方式中，所述菌株活化使用固体斜面培养基，所述固体斜面培养基和种子液培养使用的种子培养基均含有蛋白胨、酵母浸粉和葡萄糖，所述蛋白胨、酵母浸粉和葡萄糖的质量比为0.8～1.5:0.3～0.7:1。
[0020]优选地，所述蛋白胨、酵母浸粉和葡萄糖的质量比为1:0.5:1。
[0021]优选地，所述固体斜面培养基含有蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖10g/L和琼脂10g/L；
[0022]优选地，所述种子培养基含有蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L和葡萄糖10g/L。
[0023]在可选的实施方式中，所述发酵培养使用的初始发酵培养基含有甘油15～25g/L，硫酸钙0.7～1.5g/L，硫酸钾8～15g/L，七水硫酸镁5～10g/L，氢氧化钾0.6～1.5g/L，85％磷酸15～25g/L。
[0024]优选地，所述初始发酵培养基含有甘油20g/L，硫酸钙1g/L，硫酸钾10g/L，七水硫酸镁8g/L，氢氧化钾1g/L，85％磷酸20g/L。
[0025]在可选的实施方式中，所述菌株为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，保藏编号为CGMCC No.26595。
[0026]第二方面，本专利技术提供采用前述实施方式任一项所述制备方法得到的含有壳聚糖酶的发酵液或粗液分离后的粗酶液。
[0027]优选地，所述发酵液中菌体湿重为470～500g/L。
[0028]优选地，所述发酵的时间为112～124h。
[0029]在可选的实施方式中，所述粗酶液的酶活为40000～50000U/mL，壳聚糖酶含量为
17～20mg/mL。
[0030]本专利技术提供的高活性壳聚糖酶的制备方法中的发酵培养和诱导表达共包括四个阶段。甘油分批补料阶段中，甘油流加和甘油
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甲醇流加相结合，可提高菌体对甲醇诱导的适应性，缩短诱导时菌体对甲醇的适应时间。恒速甲醇流加诱导和甲醇
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糖醇溶氧反馈控制诱导，可降低甲醇累积量并减轻后期甲醇的毒害作用，明显提高壳聚糖酶的表达量和酶活性。本专利技术通过重组巴斯德毕赤酵母生产的壳聚糖酶发酵液中菌体湿重为470～500g/L，粗酶液的酶活为40000～50000U/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高活性壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，包括：所述制备方法依次包括菌株活化、种子液培养、发酵培养、诱导表达和粗液分离；所述发酵培养依次包括菌体富集阶段和甘油分批补料阶段，所述甘油分批补料阶段的具体步骤为：待培养基中甘油耗尽，溶氧回升至峰值后流加50％(w/v)的甘油水混合物，通过调整补料流速保持DO﹥25％，待菌体湿重达到100～130g/L后，流加甘油
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甲醇混合液，继续培养，直至菌体湿重达到200～250g/L；所述诱导表达依次包括恒速流加诱导和溶氧反馈诱导，所述恒速流加诱导的具体步骤包括：甘油补料停止后，直接流加甲醇，甲醇流加速度为8～15ml/h/L初始发酵培养基，发酵温度控制为25～28℃，直至菌体湿重达到350～380g/L；所述溶氧反馈诱导的具体步骤包括：流加甲醇
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糖醇混合液，DO控制为25～35％。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甘油
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甲醇混合液中甲醇的浓度(v/v)为0.1～0.5％。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的糖醇为选自甘露糖醇、山梨糖醇或麦芽糖醇中的至少一种。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甲醇
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糖醇混合液为甲醇与500g/L糖醇溶液的混合液，所述甲醇与糖醇溶液的质量比为4：1～2：1。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菌体富集阶段的培养条件包括：种子液的接种量为1％～5％(v/v)，培养温度为28～30℃，转速为480～520rpm，发酵罐压为0.04～0.06Mpa，通风比为1.0～1.5vvm，pH为4.8～5...

【专利技术属性】
技术研发人员：高小佳，朱孔山，张洪敏，苏海榆，杨娜，孙杉杉，丁秀梅，徐志文，
申请(专利权)人：秦皇岛惠恩生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：