酶活提高的β-1,3-葡聚糖酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了酶活提高的β

【技术实现步骤摘要】
酶活提高的
β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶突变体


[0001]本专利技术涉及酶活提高的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程


技术介绍

[0002]β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶(β
‑
1,3
‑
glucanase,EC3.2.1.39)简称β
‑
1,3
‑
GA，是一类能特异作用于β
‑
葡聚糖中β
‑
1,3
‑
糖苷键的酶系，可用于β
‑
1,3
‑
葡寡糖的生产。β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶广泛存在于细菌、真菌、植物和无脊椎动物中。不同来源的β
‑
1,3
‑
GA分子量范围，最适pH、最适温度等酶学性质具有明显的差异。
[0003]目前，β
‑
1,3
‑
GA主要被研究用于β
‑
1,3
‑
葡寡糖的生产，具有转化率高、过程控制简单、反应条件温和、原材料丰富等优势。然而，目前已从真菌、细菌以及放线菌等中分离得到的产β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶的大多数菌株内切酶活性和比例依然较低。因此，寻找催化效率更高、安全稳定的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶成为通过酶高效制备β
‑
1,3
‑
葡寡糖从而提高其应用价值的关键策略。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术通过对Alkalihalobacillus clausii来源的登录号为WP_095336276.1的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)进行分子改造，运用定点突变技术获得比酶活显著提高的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶突变体。
[0005]本专利技术提供了一种β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶的第71位，第128位，第198位，第106位，第120位，第87位，第151位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到的。
[0006]在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶的第71位谷氨酰胺，第128位甘氨酸，第198位天冬氨酸，第106位精氨酸，第120位甲硫氨酸，第87位赖氨酸或第151位丙氨酸进行突变得到的。
[0007]在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶的第71位谷氨酰胺突变为赖氨酸，获得突变体Q71K，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶的第128位甘氨酸突变为甲硫氨酸，获得突变体G128M，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶的第198位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，获得突变体N198Q，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0010]在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β
‑
1,3
‑
葡
聚糖酶的第106位精氨酸突变为赖氨酸，获得突变体R106K，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0011]在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶的第120位甲硫氨酸突变为亮氨酸，获得突变体M120L，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0012]在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶的第87位赖氨酸突变为精氨酸，获得突变体K87R，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0013]在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶的第151位丙氨酸突变为苏氨酸，获得突变体A151T，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0014]本专利技术还提供了编码所述突变体的基因。
[0015]在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10～16所示。
[0016]本专利技术还提供了携带所述基因的重组质粒。
[0017]在一种实施方式中，所述重组质粒包括但不限于pET系列质粒。
[0018]在一种实施方式中，所述pET系列质粒包括pET
‑
28a或pET
‑
22b。
[0019]本专利技术还提供了表达所述突变体的重组微生物细胞。
[0020]在一种实施方式中，所述重组微生物细胞包括但不限于细菌或真菌。
[0021]在一种实施方式中，所述微生物为大肠杆菌。
[0022]在一种实施方式中，所述大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET
‑
28a为载体。
[0023]本专利技术还提供一种提高β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶酶活的方法，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶基因的第71位谷氨酰胺，第128位甘氨酸，第198位天冬氨酸，第106位精氨酸，第120位甲硫氨酸，第87位赖氨酸，或第151位丙氨酸进行突变。
[0024]在一种实施方式中，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β
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1,3
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葡聚糖酶的第71位谷氨酰胺突变为赖氨酸，或将第128位甘氨酸突变为甲硫氨酸，或将第198位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，或将第106位精氨酸突变为赖氨酸，或将第120位甲硫氨酸突变为亮氨酸，或将第87位赖氨酸突变为精氨酸，或将第151位丙氨酸突变为苏氨酸。
[0025]本专利技术还提供了一种制备β
‑
1,3葡寡糖的方法，所述方法为以β
‑
葡聚糖为底物，利用上述β
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶突变体，其特征在于，在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶的基础上，进行了如下至少一种突变：(1)将第151位丙氨酸突变为苏氨酸；(2)将第87位赖氨酸突变为精氨酸；(3)将第120位甲硫氨酸突变为亮氨酸；(4)将第106位精氨酸突变为赖氨酸；(5)将第198位天冬氨酸突变为谷氨酰胺；(6)将第128位甘氨酸突变为甲硫氨酸；(7)将第71位谷氨酰胺突变为赖氨酸。2.编码权利要求1所述突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。4.表达权利要求1所述突变体或携带权利要求3所述重组质粒的重组微生物细胞。5.根据权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，重组微生物细胞为细菌或真菌。6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物细胞为大肠杆菌。7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET
‑
28a为载体。8.一种提高β
‑
1,3

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，张懿玲，魏哲，江波，吕厚臣，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：