产物聚合度改变的壳聚糖酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于酶工程技术领域，具体涉及一种改变产物聚合度的壳聚糖酶突变体及其应用。将来源于枯草芽孢杆菌的46家族糖苷水解酶壳聚糖酶（BsCsn46A），氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，第50位苏氨酸突变成大体积疏水侧链氨基酸W或小体积侧链氨基酸A；突变体分别为T50A、T50W。与原始酶相比，壳聚糖酶突变体酶水解壳聚糖除产生COS2和COS3外，还有壳四糖（COS4）生成。成。

【技术实现步骤摘要】
产物聚合度改变的壳聚糖酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，特别涉及一种产物聚合度改变的壳聚糖酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]壳聚糖是由β
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1,4
‑
糖苷键连接氨基葡萄糖形成的线性多糖，是自然界存在的唯一碱性多糖，其来源丰富，是地球上仅次于纤维素的第二大天然高分子化合物。有研究表明壳聚糖经降解成为壳寡糖后，具有显著的抑菌作用，可广泛应用于医药、农业、食品等方面，潜在应用价值可观。
[0003]壳寡糖的生产方法主要为化学法、物理法和生物酶法三种，而出于产品的安全性、降解成本、环境友好的角度考虑，工业化通常采用酶解法降解壳聚糖。特别地，酶法水解壳聚糖专一性强，反应条件温和，易于制备，是更为安全成熟的生产方式。
[0004]壳聚糖酶是专门用以降解壳聚糖为壳寡糖的一种糖苷水解酶，大多数壳聚糖酶以内切的方式断开壳聚糖分子中的β
‑
1,4
‑
糖苷键，该水解过程可以降解得到聚合度不同的水溶性壳寡糖。
[0005]随着对壳寡糖研究的深入，科学家们发现，壳寡糖聚合度在4
‑
8时才能最大限度发挥它的抗菌性能，而目前壳聚糖酶的研究热点主要是针对壳聚糖酶的工业化应用，在于提高其酶活和稳定性，但关于制备指定聚合度的壳寡糖的研究报道较少。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供能改变壳寡糖产物聚合度的壳聚糖酶突变体，并利用突变体水解壳聚糖产壳寡糖。本专利技术涉及的改变了产物聚合度的壳聚糖酶突变体，通过对本实验室前期获得了一株壳聚糖酶突变体做进一步的改造工作，使本专利技术涉及的突变体产COS2、COS3和COS4。
[0007]本专利技术以实验室前期保存的壳聚糖酶BsCsn46A为出发酶，通过对BsCsn46A氨基酸序列第50位单点突变，突变体分别为氨基酸序列中的第50位苏氨酸突变为丙氨酸（T50A），或第50位苏氨酸突变为色氨酸（T50W）。
[0008]本专利技术涉及的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）壳聚糖酶（BsCsn46A）是实验室前期克隆得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009]其中，突变体T50A的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；突变体T50W的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0010]本专利技术进一步提供了携带有上述任一编码壳聚糖酶突变体的基因的重组载体以及转化/转染重组载体的重组菌。
[0011]本专利技术还提供了上述壳聚糖酶突变体在催化水解壳聚糖产壳寡糖上的应用，具体的，本专利技术的突变体在催化水解壳聚糖过程中，除了生成COS2和COS3，还能生成COS4。
[0012]本专利技术提供的壳聚糖酶突变体与野生壳聚糖酶相比，在酶水解壳聚糖过程中，除
了生成COS2和COS3，突变壳聚糖酶的水解产物明显增加，生成了大量COS4，而COS4的抗菌功能要显著高于低聚合度的壳寡糖。将该壳聚糖酶突变体应用于水解具有高抗菌活性的壳寡糖具有广阔的应用前景。
附图说明
[0013]图1为本专利技术实施例中的野生型壳聚糖酶及其突变体催化壳聚糖水解产物的薄层色谱图；图2为本专利技术实施例中的野生型壳聚糖酶及其突变体催化壳聚糖水解产物的高效液相色谱图。
具体实施方式
[0014]下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。
[0015]利用Swiss
‑
Model以壳聚糖酶BsCsn46A为模板进行模拟蛋白质空间结构，再通过底物通道模拟与分子对接，确定与水解底物相关的直接活性位点，选取第50位进行定点突变，分别突变为大体积疏水侧链的氨基酸W和小体积侧链的氨基酸A，并在E. coli BL21（DE3）中进行了功能表达。
[0016]本专利技术以实验室前期保存的壳聚糖酶BsCsn46A为出发酶，将第50位点分别突变为大体积疏水侧链的氨基酸W和小体积侧链的氨基酸A，并对突变体的水解性质进行研究分析发现产物聚合度发生改变。
[0017]引物序列如下：引物名称引物用途引物（5
’‑3’
）bscsnFBsCsn46ACGGGATCCGCGGGACTGAATAAAGATCbscsnRBsCsn46ACCCAAGCTTTTATTTGATTACAAAATTACCT50AFT50AGGCTTTACAACGGCTGCTGGGGATGCATTGGAAGT50ART50ACTTCCAATGCATCCCCAGCAGCCGTTGTAAAGCCT50WFT50WGGCTTTACAACGGCTTGGGGGGATGCATTGGAAGT50WRT50WCTTCCAATGCATCCCCCCAAGCCGTTGTAAAGCCPCR体系：试剂名称体积（μL）模板1PCRBuffer5dNTP1上、下游引物1PfuDNA聚合酶1.2ddH2O39.8总体积50PCR扩增条件：95℃预变性3 min；95℃变性30s，64℃退火1min，68℃延伸10min，15个循环，4℃保温。
[0018]1.DpnI 消化模板质粒
取20μL PCR产物，在PCR产物中直接添加1μL DpnI 限制性内切酶。
[0019]2.转入大肠杆菌取10 μL酶切产物直接转化E.coli DH5α感受态细胞。将携带突变质粒的重组菌送至上海生物工程有限公司测序。将测序正确的突变质粒转化至E.coli BL21中。
[0020]3.蛋白纯化取1 mL活化的菌液转接入装有50 mL LB液体培养基的锥形瓶中，加入25 μL 50 mg/L的卡那霉素（Kana）于培养基中，放入37℃、160r/min的恒温振荡摇床中培养3小时。经过3小时后在菌液中加入终浓度为1 μmol/L的诱导剂（IPTG）以诱导细菌产生蛋白，于16
°
C、160 r/min 的恒温振荡摇床中过夜培养，将扩大培养后的细菌倒入50 mL离心管中，放入冷冻离心机中，设置8000 rpm、5 min离心，倒掉上清，收集沉淀在离心管底部的菌体，加入5 mL M0（0.02M Tris
‑
HCl，pH 8.0，0.5M NaCl，10%甘油），将原本分装在两管的细菌并入一管中，设置8000 rpm、5 min离心，再次倒掉上清，加入5 mL M0重悬。使用超声波细胞破碎机破碎细胞，根据菌液量适当增加或减少破碎时间，一般设置工作时间12 min，运行1 s，暂停3 s.收集破碎完全后的菌液，在4
ꢀ°
C的条件下，设定10000 rpm、30 min离心，收集上清液。将超声破碎重组菌获得的粗酶液上样至Ni
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NTA亲和层析柱，用0.02 M咪唑洗脱液（0.02M Tris
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HCl，pH 8.0，0.5M NaCl，0.02M咪唑和10%甘油）洗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产物聚合度改变的壳聚糖酶突变体，其特征在于，所述产物聚合度改变的壳聚糖酶突变体为壳聚糖酶BsCsn46A氨基酸序列中的第50位苏氨酸突变为丙氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；或第50位苏氨酸突变为色氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。2.编码权利要求1所述的产物聚合度改变的壳聚糖酶突变体的基因，其特征在于，所述SEQ ID NO：3的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭静，高文君，陈培滔，丁飞，满在伟，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：