单产壳二糖的壳聚糖酶突变体制造技术

本发明专利技术属于酶工程技术领域，公开了单产壳二糖的壳聚糖酶突变体。对来源于枯草芽孢杆菌中克隆的新的46家族糖苷水解酶壳聚糖酶（BsCsn46A），氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示进行定点突变，壳聚糖酶的突变体为G21W、E235R、Y236K，通过水解反应分析，发现与原始酶水解壳聚糖的产物为壳二糖（COS2）和壳三糖（COS3）不同的是，本发明专利技术的突变体壳聚糖酶的水解产物主要为COS2。要为COS2。

【技术实现步骤摘要】
单产壳二糖的壳聚糖酶突变体


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种单产壳二糖的壳聚糖酶突变体。

技术介绍

[0002]壳聚糖是几丁质脱去部分乙酰基后形成的碱性多糖，属于天然高分子化合物，在自然界中含量丰富，仅次于纤维素，它的主要组成成分为氨基葡萄糖，通过β
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1，4
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糖苷键连接形成线性结构多糖，当部分糖苷键经化学、物理或生物手段断裂后，生成聚合度为2
‑
10的寡聚糖，也称壳寡糖。研究发现，低相对分子质量的寡聚糖相较于壳聚糖具有易被机体吸收的特点，此外，壳聚糖本身就具有医用、日化用品、农业方面的应用价值，被用作食品保鲜剂、医用载体材料、化妆品添加剂等，这些性能在壳聚糖降解后均有保留。特别地，壳聚糖的抑菌功效，在其聚合度降低后虽然能抑制的真菌种类减少了，但对菌类抑制的程度却显著加强，针对这一特性，如何高效获得壳寡糖成为目前壳寡糖领域的研究热点。
[0003]生产壳寡糖最绿色合理的方法是酶水解法，与化学法和物理法生产会引起的产品提纯困难、环保成本过大等问题相比，酶水解反应条件温和、易于控制，没有副产物生成，更符合现代工业化理念。
[0004]壳聚糖酶是用于降解壳聚糖为壳寡糖的糖苷水解酶，主要以内切的方式断开壳聚糖分子中的β
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1,4糖苷键形成壳寡糖。由于壳聚糖酶水解壳聚糖产壳寡糖产物为混合物，这将极大的提高后续的分离纯化成本，如能获得产单一聚合物的壳寡糖将极大降低为壳寡糖的工业化应用成本。

技术实现思路

>[0005]针对以上技术问题，本专利技术的目的在于提供能生产单一聚合度壳寡糖的壳聚糖酶突变体。
[0006]本专利技术通过计算机模拟蛋白结构与底物分子结合为理论基础进行半理性设计，对前期利用PCR技术克隆到的一种壳聚糖酶BsCsn46A进行改造，使突变体能产单一聚合度的壳二糖，无其他寡糖生成。
[0007]本专利技术涉及的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）壳聚糖酶是实验室前期克隆得到野生型壳聚糖酶（BsCsn46A），其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，基因序列为SEQ ID NO：2。
[0008]本专利技术选取了实验室前期保存的壳聚糖酶BsCsn46A氨基酸序列中的第21位甘氨酸突变为色氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，获得壳聚糖酶突变体G21W；其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，编码的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
[0009]将壳聚糖酶BsCsn46A氨基酸序列中的第235位谷氨酸突变为精氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，获得壳聚糖酶突变体E235R；其氨基酸序列为SEQ ID NO：5，编码的核苷酸序列为SEQ ID NO：6。
[0010]将壳聚糖酶BsCsn46A氨基酸序列中的第236位酪氨酸突变为赖氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，获得壳聚糖酶突变体Y236K；其氨基酸序列SEQ ID NO：7，编码的核苷酸序
列为SEQ ID NO：8。
[0011]一种重组载体，所述重组表达载体携带有上述任一种编码壳聚糖酶突变体的基因。优选的，将扩增的目的基因克隆到表达载体pET
‑
28a中，构建重组质粒。
[0012]一种重组菌，所述重组菌为转化/转染上述重组载体的宿主菌。优选的，宿主菌为大肠杆菌E.coli BL21。
[0013]本专利技术还提供了上述壳聚糖酶突变体的应用，所述壳聚糖酶突变体G21W、E235R、Y236K用于酶水解壳聚糖产壳二糖。
[0014]本专利技术提供的壳聚糖酶突变体与野生壳聚糖酶相比，在酶水解壳聚糖过程中，原始酶生成COS2和COS3，而突变壳聚糖酶的水解产物明显改变，只生成COS2，极大的降低了水解反应后续的分离纯化成本，降低为壳寡糖的工业化应用成本。
附图说明
[0015]图1为本专利技术实施例中的野生型壳聚糖酶及其突变体的壳聚糖降解产物的薄层色谱图。
实施方式
[0016]本专利技术下面结合实施例作进一步详述：这些实施仅用于说明本专利技术而不用于限制专利技术范围。
实施例
[0017]本专利技术所涉及的具体突变步骤如下:步骤1、将基因序列SEQ ID NO：2克隆至质粒pET
‑
28a中，构建重组质粒pET
‑ꢀ
BsCsn46A；两条引物分别为上游引物CGGGATCCGCGGGACTGAATAAAGATC，下游引物 CCCAAGCTTTTAAGGGATTACAAAATTACC。
[0018]步骤2、利用Swiss
‑
Model在线软件对壳聚糖酶（BsCsn46A）进行模拟，获得壳聚糖酶的空间结构；步骤3、通过底物通道模拟与分子对接找到与水解底物相关的活性位点，选取其中三个位点（21、235、236）进行代表性氨基酸突变，即G21W、E235R、Y236K；步骤4、设计定点突变引物，通过PCR技术得到突变壳聚糖酶基因，将扩增的目的基因克隆到表达载体pET
‑
28a中，构建重组质粒。
[0019]步骤5、将步骤4的重组载体转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）进行诱导培养，离心后收集菌体，经超声破碎细胞后，使用Ni
‑
NTA亲和层析柱进行蛋白纯化获得温度稳定性提高的突变壳聚糖酶。
[0020]引物序列如下：
[0021]酶切位点为BamHⅠ和HindⅢ。
[0022]PCR体系：
[0023]PCR扩增条件：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，64℃退火1 min，68℃延伸10 min，15个循环，4℃保温。
[0024]重组菌诱导表达：取20 μL PCR产物，在PCR产物中直接添加1 μL DpnI 限制性内切酶，消化模板质粒，得酶切产物。取10 μL酶切产物直接转化E.coli DH5α感受态细胞。将携带突变质粒的重组细胞送至上海生物工程有限公司测序。将测序正确的突变质粒转化至E.coli BL21中。取1 mL活化的菌液转接入装有50 mL LB液体培养基的锥形瓶中，加入25 μL 50 mg/L的卡那霉素（Kana）于培养基中，放入37
ꢀ°
C、160 r/min的恒温振荡摇床中培养3小时。经过3小时后在菌液中加入终浓度为1 μmol/L的诱导剂（IPTG）以诱导细菌产生蛋白，于16
ꢀ°
C、160 r/min 的恒温振荡摇床中过夜培养。
[0025]蛋白纯化：将扩大培养后的细菌倒入50 mL离心管中，放入冷冻离心机中，设置8000 rpm、5 min离心，倒掉上清，收集沉淀在离心管底部的菌体，加入5 mL M0（0.02M Tris
‑
HCl，pH 8.0，0.5M NaCl，10%甘油），将原本分装在两管的细菌并入一管中，设置8000 rpm、5 min离心，再次倒掉上清，加入5 mL M0重悬。将超声破碎细胞获得的粗酶液上样至Ni
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单产壳二糖的壳聚糖酶突变体，其特征在于，所述壳聚糖酶突变体为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis壳聚糖酶BsCsn46A氨基酸序列中的第21位甘氨酸突变为色氨酸，其他位置的氨基酸残基不变的壳聚糖酶突变体G21W；或枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis壳聚糖酶BsCsn46A氨基酸序列中的第235位谷氨酸突变为精氨酸，其他位置的氨基酸残基不变的壳聚糖酶突变体E235R；或枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis壳聚糖酶BsCsn46A氨基酸序列中的第236位酪氨酸突变为赖氨酸，其他位置的氨基酸残基不变的壳聚糖酶突变体Y236K；所述壳聚糖酶BsCsn46A氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的单产壳二糖的壳聚糖酶突变体，其特征在于，壳聚糖酶突变体G21W的氨基酸序列如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭静，高文君，王朝，丁飞，满在伟，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：